缺氧诱导因子1α调控2型谷氨酰胺酶促进结肠癌耐药的机制及临床意义研究

摘要

目的：结肠癌是人类最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和死亡率多年来居高不下。近年来随着化疗方案的不断更新使得结肠癌的治疗效果有所提升，但患者对治疗反应不一，获益率差异较大，以及由耐药引起的复发和转移是进一步提高疗效的主要障碍。代谢模式的多样性是恶性肿瘤的重要特征，其不仅在肿瘤发生发展中发挥重要作用，同时也是恶性细胞在面对化疗压力时得以存活的根本保障。因此，深入研究结肠癌化疗耐受情况下肿瘤代谢改变及调控机制，不仅可以阐明结肠癌化疗耐受的分子机制，而且可以通过对特定细胞代谢途径或代谢产物的调控，为逆转耐药寻找新的靶点。
　　缺氧是实体肿瘤的重要特征之一，而缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作为其关键的中间分子，在对肿瘤代谢等方面起着主要的调控作用。同时缺氧条件下谷氨酰胺(Gln)的转运、合成与利用均增加，但是具体的分子机制目前尚不明确。Gln在其代谢关键酶2型谷氨酰胺酶(GLS2)的作用下脱氨基生成谷氨酸(Glu)。一方面，Glu可反应生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环（TCA循环）起“回补作用”，从而为TCA循环提供因肿瘤细胞合成代谢增强而减少的中间代谢产物;另一方面，Glu可在谷胱甘肽合成酶系的催化下，生成谷胱甘肽(GSH)与多种化疗药物反应，增加药物的排出，降低药物在细胞内的浓度以及增强DNA损伤修复功能，最终引起肿瘤细胞的耐药。在本研究中，我们发现缺氧条件下结肠癌细胞株对化疗不敏感，同时耐药结肠癌细胞株中HIF-1α和GLS2的表达均升高，在此基础上，初步探讨了HIF-1α通过对GLS2进行调控影响了谷氨酰胺的代谢，最终引起结肠癌化疗耐受，为逆转耐药提供新的策略。同时，采用免疫组化法检测了HIF-1α和GLS2在结直肠癌组织标本中的表达，并且探讨其临床意义，进而为临床诊治提供新的线索。
　　方法:第一部分
　　(1)分别在常氧(20％O2)和缺氧(1％O2)不同时间点(12h、24h、36h、48h、72h)的条件下处理结肠癌细胞株Lovo后，Western Blot检测HIF-1α的表达;
　　(2)分别在20％O2和1％O2条件下用结肠癌化疗药物奥沙利铂(OXA)和5-氟尿嘧啶（5-Fu）处理Lovo细胞48h后，CCK8检测细胞增殖活性;
　　(3) Western Blot检测HCT-116、HCT-116/OXA、HCT-8和HCT-8/5-Fu中HIF-1α、缺氧诱导因子2α(HIF-2α)、1型谷氨酰胺酶(GLS1)和GLS2的表达。
　　第二部分
　　(1)通过慢病毒敲低HIF-1α，构建HIF-1αKD的Lovo细胞株，在20％O2和1％O2处理12h后，Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;
　　(2)通过慢病毒过表达HIF-1α，构建HIF-1αOE的Lovo细胞株，Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;
　　(3)通过临床数据库ICGC对GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达相关性进行分析;
　　(4)通过基因数据库分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似程度;
　　(5)荧光素酶报告基因检测HIF-1α对GLS2转录的启动活性。
　　第三部分
　　(1)通过慢病毒敲低HIF-1αOE组Lovo细胞中的GLS2，构建HIF-1αOE+GLS2KDLovo细胞株;
　　(2) GSH检测试剂盒分别检测WT、Ctr、HIF-1αOE、HIF-1αOE+GLS2KD四组Lovo细胞中GSH水平;
　　(3)分别用OXA和5-Fu处理WT、Ctr、HIF-1αOE、HIF-1αOE+GLS2KD、HIF-1αOE+H2O2五组Lovo细胞48h后，CCK8检测细胞增殖活性。
　　第四部分
　　(1)免疫组化法检测结直肠癌术后108例组织标本（其中23例含癌旁黏膜组织）中HIF-1α和GLS2的表达，并分析二者的表达与临床病理参数的相关性;
　　(2)采用Spearman等级相关分析HIF-1α和GLS2的表达之间的相关性，Kaplan-Meier法分析结直肠癌中HIF-1α和GLS2的表达与患者预后的关系，Cox回归模型分析结直肠癌患者预后的影响因素。
　　结果:1、缺氧通过促进HIF-1α的表达参与结肠癌细胞耐药
　　1％O2处理Lovo细胞12h时HIF-1α表达水平最高;OXA或5-Fu处理细胞后，1％O2组的Lovo细胞增殖活性均较20％O2组强;相较于野生型结肠癌细胞株HCT-116和HCT-8，耐药细胞株HCT-116/OXA和HCT-8/5-Fu中HIF-1α和GLS2的表达均增高，而HIF-2α和GLS1无明显变化。
　　2、HIF-1α通过转录调控促进GLS2的表达
　　缺氧时敲低HIF-1α，GLS2的表达随之降低;常氧时过表达HIF-1α，GLS2的表达随之升高;临床数据库ICGC分析发现GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达存在明显正相关;基因数据库TRANSFAC MATRIX TABLE分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似度为99.8％;荧光素酶报告基因发现HIF-1α能够启动GLS2的转录，同时将GLS2的启动子序列突变以后HIF-1α对其的启动活性随之下降。
　　3、HIF-1α通过提高GSH水平促进结肠癌细胞耐药
　　过表达HIF-1α时GSH水平升高，敲低GLS2后GSH水平随之下降;OXA或5-Fu处理细胞后，过表达HIF-1α时细胞增殖活性增强，但在加入H2O2或敲低GLS2后，细胞的增殖活性随之下降。
　　4、HIF-1α和GLS2在结直肠癌中的表达及临床意义
　　结直肠癌组织中HIF-1α和GLS2的表达均明显高于癌旁黏膜组织，且差异具有统计学意义(P＜0.01)。其中，HIF-1α的表达与年龄、TNM分期、淋巴结转移、术后远处转移有关（P＜0.05），而GLS2的表达则与年龄、浸润深度、术后远处转移有关(P＜0.05)。同时，HIF-1α和GLS2的表达呈显著正相关(r=0.464，P＜0.01)，且二者均与结直肠癌患者的预后有关;Cox回归分析也显示TNM分期、术后远处转移、HIF-1α、 GLS2均是结直肠癌预后的独立影响因素(P＜0.05)。
　　结论:HIF-1α作为重要的转录因予，缺氧时其表达明显增高，且与结肠癌耐药密切相关，它通过转录调控GLS2的表达，促进GSH的合成进而引起结肠癌细胞的化疗耐药;同时结直肠癌患者中HIF-1α、GLS2高表达组的预后均比低表达组的差，提示二者可能在结直肠癌的发生、发展中起着重要的作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 缺氧通过促进HIF-1α的表达参与结肠癌细胞耐药

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 HIF-1α通过转录调控促进GLS2的表达

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 HIF-1α通过提高GSH水平促进结肠癌细胞耐药

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 HIF-1α和GLS2在结直肠癌中的表达及临床意义

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 缺氧和缺氧诱导因子与肿瘤代谢

研究生期间主要发表的论文

致谢