解偶联蛋白2在脂多糖诱导的急性肺损伤中的作用及机制研究

摘要

目的:
　　急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)是临床常见的危重症，虽然已经对ALI/ARDS进行了长期的研究，但目前仍缺乏有效的治疗手段，病死率仍高达30～40％。ALI/ARDS的发生、发展是全身失控性炎症反应的结果，病理特征包括中性粒细胞聚集，肺泡-毛细血管的损伤和通透性增加，肺内大量蛋白和炎症因子渗出。线粒体在肺泡上皮损伤中发挥着重要作用，参与了细胞凋亡信号通路，如调节活性氧生成、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)平衡，稳定线粒体膜电位，或控制钙稳态。此外，研究表明，线粒体和炎症反应的相互作用在炎症性疾病中占有重要地位，但两者在急性肺损伤发病机制中的作用尚不清楚。
　　解偶联蛋白(Uncoupling proteins，UCPs)是位于线粒体内膜的阴离子质子转运蛋白家族的成员，调控免疫应答和炎症反应，目前在人类中共发现5种亚型，分别命名为UCP1～5，其中UCP2是研究得较早较多的解偶联蛋白，目前发现UCP2在心脏、脑、肝脏等器官的炎症损伤中发挥了重要作用。已有文献报道在系统性炎症和感染的患者体内UCP2表达增加，与患者的死亡率存在相关性。急性肺损伤是全身失控性炎症反应的结果，因此UCP2可能成为急性肺损伤治疗的潜在靶点。但UCP2在急性肺损伤中的作用尚未见文献报道，本研究探讨了UCP2在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型炎症损伤中的作用及机制。
　　本研究构建了过表达UCP2的腺病毒载体，体内转染C57BL/6小鼠，上调小鼠肺组织UCP2的表达;通过京尼平下调UCP2的表达。在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中，通过Western Blot(WB)、免疫组化检测腺病毒在小鼠肺组织中UCP2的表达情况;观察UCP2对肺组织病理改变和肺泡-毛细血管屏障通透性、细胞因子、细胞凋亡的影响;线粒体功能的改变;MAPK、NF-κB通路的激活情况，探讨UCP2在ALI/ARDS发生、发展中的作用，为ALI/ARDS的防治提供新的靶点和方向。
　　方法:
　　(1) UCP2过表达慢病毒载体的构建
　　分离小鼠外周血单个核细胞提取总RNA，RT-PCR扩增小鼠UCP2 cDNA，将其亚克隆至病毒穿梭载体PYr-adshuttle-1进行DNA测序鉴定，并转染HEK293细胞进行病毒包装，获得重组腺病毒UCP2-Ad。用经鼻滴注建立C57BL/6J小鼠腺病毒UCP2-Ad体内感染模型，同时使用空病毒载体UCP2-NC作为阴性对照，通过免疫组化、WesternBlot检测UCP2在肺组织的表达情况。
　　(2)观察UCP2对急性肺损伤小鼠炎症损伤的影响
　　腺病毒转染后第3d腹腔注射LPS(15 mg/kg)建立急性肺损伤小鼠模型。LPS处理前使用京尼平预处理，抑制肺组织UCP2的表达。ALI后24 h处死小鼠，检测小鼠肺组织病理改变、肺水肿程度、支气管肺泡灌洗液中炎症因子含量，探讨UCP2对肺组织炎症损伤的影响;通过Western Blot检测cleaved caspase3表达、细胞色素C的释放和Bcl-2家族蛋白在各组小鼠肺组织的表达，TUNEL检测肺泡细胞凋亡情况，探讨UCP2对肺泡上皮细胞凋亡的影响。
　　(3)观察UCP2对急性肺损伤后MAPK和NF-κB通路的影响
　　进一步观察UCP2对急性肺损伤后促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响，通过Western Blot检测p38 MAPK、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的激活情况，ELISA检测炎症因子的水平，并分别给予p38 MAPK特异性抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125或ERK抑制剂PD98059，观察UCP2对MAPK信号通路和下游炎症因子的影响，并明确哪一条MAPK信号通路参与了UCP2调控的肺部炎症损伤。观察京尼平对MAPK信号通路的影响，进一步证实京尼平通过哪条信号通路保护LPS诱导的急性肺损伤。此外，观察UCP2和京尼平对NF-κB信号通路的影响，并通过检测ATP水平和5'-AMP激活性蛋白激酶(5'-AMP-activated protein kinase，AMPK)信号通路的激活情况明确其调控机制。
　　结果:
　　(1)成功构建了过表达UCP2的腺病毒载体UCP2-Ad和对照空载病毒UCP2-NC。通过免疫组化和Western Blot证实腺病毒体内转染可以显著增加肺组织UCP2的表达(P＜0.05)，主要表达于肺泡细胞。UCP2-Ad感染滴度为5×108 pfu/鼠，最佳感染时间为3d，并且通过病理学检测证实腺病毒体内转染不会引起肺组织炎症反应。
　　(2)UCP2表达于正常小鼠肺组织，LPS处理后UCP2的表达显著增加(P＜0.05);UCP2过表达可显著加重LPS引起的肺组织病理改变、增加炎症细胞浸润、肺组织出血，增加肺组织湿干重比(P＜0.05)，促进肺水肿;增加炎症因子TNF-、IL-1β的表达(P＜0.05);降低急性肺损伤小鼠的存活率(P＜0.05)。此外，UCP2加重肺泡细胞线粒体功能不全，减少ATP生成，增加促凋亡蛋白Bax的表达，促进细胞色素C释放，增加激活型caspase3的表达，TUNEL阳性细胞显著增加，促进细胞凋亡(P＜0.05)。相反，京尼平抑制UCP2的表达可以显著减轻急性肺损伤后肺组织的炎症损伤和细胞凋亡。
　　(3) UCP2促进了肺损伤后MAPK通路p38 MAPK、JNK、ERK的激活，促进TNF-α、IL-1β的释放。P38、JNK抑制剂能显著抑制UCP2诱导的细胞凋亡和炎症因子释放，但ERK抑制剂没有作用，结果提示UCP2可能是通过p38 MAPK、JNK通路，而不是通过ERK通路促进肺组织炎症损伤和细胞凋亡。此外，UCP2通过抑制ATP水平激活AMPK通路，进而激活了NF-κB。UCP2抑制剂京尼平可以显著抑制p38MAPK、JNK、NF-κB通路的激活、细胞凋亡和炎症因子的释放。
　　结论:
　　(1)上调UCP2的表达加重急性肺损伤炎症损伤，下调UCP2的表达对急性肺损伤起保护作用;
　　(2) UCP2加重ALI肺组织线粒体功能障碍，促进肺泡上皮细胞凋亡;
　　(3) JNK、p38 MAPK、NF-κB信号通路可能参与了UCP2对急性肺损伤的调控作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 调节小鼠肺组织UCP2的表达

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 UCP2加重脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的炎症损伤

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 UCP2对急性肺损伤后MAPK和NF-κB信号通路的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述一 UCP2在疾病中作用的研究进展

文献综述二 线粒体解偶联蛋白2在炎症中的作用

攻读博士学位期间发表的文章

致谢