早发型重度子痫前期合体滋养细胞外囊泡的差异蛋白质组学研究

摘要

背景与目的:
　　妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的一组疾病，我国的发病率约5％-8％，是导致孕产妇死亡的重要原因，约占妊娠相关死亡总数的10％-16％[1]。子痫前期(pre-eclampsia，PE)/子痫(eclampsia)是妊娠期高血压疾病中最严重的类型，特指妊娠20周后新出现的高血压和蛋白尿，常继发母体多器官功能受损及胎儿并发症。按照病情的轻重分为轻度子痫前期(mild pre-eclampsia，mPE)和重度子痫前期(severe pre-eclampsia，sPE)，以妊娠34周发病为界限，又分为早发型（＜34周）和晚发型（≥34周）两种亚型，尤其以早发型重度子痫前期(early-onset sPE)危害性大，严重威胁母儿近期及远期的健康和生存质量。然而，PE的确切病因和发病机制仍未阐明，目前缺乏简便、有效、可靠和经济的疾病预测方法，临床治疗陷于被动，长期以来以“对症治疗结合终止妊娠”为主，母儿结局并不乐观。
　　生物体内最终执行功能的是蛋白质，PE患者体内产生的STB-EVs可能在“质量”即蛋白质成分构成上不同于正常妊娠状态[10]。因此全面解析PE及正常妊娠时STB-EVs的差异蛋白质表达谱，在此基础上挖掘关键的致病因子，为进一步探索STB-EVs导致PE发病的具体机制、疾病的早期诊断及临床疗效的评估等奠定重要的研究基础。此外，对STB-EVs相关致病因子进行干预和阻断，也将为PE的临床治疗提供新的思路与策略。
　　差异蛋白质组学着重于筛选和鉴定不同种类或不同状态下各样本间蛋白质组的区别和变化，在疾病的早期诊断、病情进展的监控和临床治疗效果的判断等方面具有光明的应用前景。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation，iTRAQ)是近年来运用广泛的一种新型蛋白质组学定量研究技术，具有高通量、高灵敏度、低检测限、分离能力强、分析范围广等特点。本研究采用iTRAQ定量蛋白组学相关技术分析早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘合体滋养细胞外囊泡的差异表达蛋白，并进一步研究差异表达蛋白唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素6(sialic acid-binding Ig-like lectin6，Siglec-6)在血管内皮损伤中的作用及相关机制。
　　材料与方法:
　　1、获取早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女胎盘组织，采用绒毛组织块培养结合四步差速/超速离心法体外制备胎盘STB-EVs，应用扫描电镜、免疫电镜及Westernblotting方法进行形态学及免疫来源的鉴定。
　　2、通过iTRAQ定量蛋白组学技术结合生物信息学方法分析早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女胎盘STB-EVs中差异表达的蛋白质，并应用Western blotting方法对差异表达的蛋白进行验证。
　　3、获取健康未孕妇女、早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女分娩前及分娩后的血浆。通过Western blotting方法分析早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血浆中Siglec-6蛋白的表达情况，并进一步用ELISA法测定Siglec-6在健康未孕妇女、早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女分娩前及分娩后血浆中的含量。
　　4、以人脐静脉内皮细胞HUVEC为实验平台，利用CCK-8细胞增殖实验检测Siglec-6在不同的处理浓度及处理时间条件下对HUVEC细胞增殖的反应;利用细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验检测不同的Siglec-6处理对HUVEC细胞水平迁移和固有迁移能力的影响;利用TUNEL法检测Siglec-6处理对HUVEC细胞凋亡的影响;利用ELISA法测定不同的Siglec-6处理对HUVEC细胞分泌IL-6、TNF-α及VEGF的影响;采用Westem blotting检测Siglec-6处理后HUVEC细胞中磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)的表达及蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB/AKT)磷酸化水平的变化情况。
　　结果:
　　1、扫描电镜和免疫电镜显示STB-EVs呈圆形、球形、狭长型、杯形甚至不规则形，大小各异，多个囊泡聚集成团，囊泡大小在30nm-1700nm之间，与前期研究相吻合[9]。免疫电镜证实了STB-EVs的滋养细胞来源特性。Western blotting检测表明STB-EVs中存在Hsp70、Tsg101及Flotillin-1等囊泡标志蛋白。
　　2、运用iTRAQ定量蛋白质组学相关技术对早发型重度子痫前期患者与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs进行差异蛋白质分析，共鉴定出194个差异表达的蛋白，其中122个差异蛋白在病例组表达上调，72个表达下调。进一步的生物信息学分析表明这些差异表达蛋白参与细胞组成、生物过程和分子功能分别富集于线粒体、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面。差异表达蛋白参与的主要代谢及信号通路为糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、脂肪酸延伸、类固醇激素生物合成以及氧化磷酸化。在早发型重度子痫前期组表达上调的差异表达蛋白涉及炎症反应、凝血过程、抗血管生成、免疫调节等子痫前期发病的主要病理生理过程，候选蛋白包括S100-A8，C4b-B，CD63，ATP synthasesubunit beta, cDNA FLJ14908 fis, endoglin, interleukin-27 subunit beta, F11 receptor,isoform CRA_a, dynamin-2,protein SEC13 homolog,calnexin, serpin B9,stomatin-like protein2,phosphoinositide3-kinase adapter protein1和 dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase48 kDa subunit。Siglec-6是早发型重度子痫前期胎盘STB-EVs中上调最为显著的蛋白。Western blotting方法检测差异表达蛋白CD63、S100-A8、Siglec-6以及Calnexin的表达，验证了其与iTRAQ定量分析的结果一致。
　　3、Western blotting方法证实早发型重度子痫前期患者血浆中Siglec-6蛋白的水平显著高于正常妊娠妇女。ELISA检测Siglec-6在健康未孕女性外周血中几乎无表达(0.08±0.0007 ng/ml)，在未分娩的早发型重度子痫前期患者及正常妊娠妇女血浆中的含量分别为0.80±0.23 ng/ml和0.21±0.04 ng/ml，且分娩后Siglec-6的表达迅速降低，分别为0.09±0.007 ng/ml及0.09±0.01 ng/ml，接近未孕水平。
　　4、CCK-8细胞增殖实验表明Siglec-6处理可抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的增殖，在测试的浓度和时间中，以2.0 ng/ml的Siglec-6处理48h对细胞增殖的抑制作用最强(P＜0.05); Transwell小室迁移实验显示2.0 ng/ml的Siglec-6显著抑制HUVEC细胞在水平方向迁移能力（P＜0.05）;细胞划痕实验显示2.0 ng/ml的Siglec-6可抑制HUVEC细胞的固有迁移能力（P＜0.05），浓度升高至5.0 ng/ml时对HUVEC细胞固有迁移能力的抑制作用更明显(P＜0.05); TUNEL法检测结果表明2.0 ng/ml的Siglec-6可促进HUVEC细胞的凋亡(P＜0.05); ELISA测定结果显示:Siglec-6以剂量和时间依赖模式促进HUVEC细胞分泌IL-6与TNF-α(P＜0.05)，Siglec-6抑制HUVEC细胞分泌VEGF(P＜0.05)，且这种抑制作用与Siglec-6的剂量和作用时间不相关。Westernblotting检测结果显示，Siglec-6可致HUVEC细胞中PI3K的表达以及AKT磷酸化水平降低（P＜0.05）。
　　结论:
　　1、早发型重度子痫前期与正常妊娠妇女胎盘STB-EVs的蛋白质表达谱存在差异。筛选发现Siglec-6是早发型重度子痫前期STB-EVs中上调最显著的差异表达蛋白。
　　2、Siglec-6在早发型重度子痫前期患者外周血中的表达水平显著高于正常妊娠组，其含量约为正常妊娠妇女的4倍，且分娩后表达迅速降低，接近未孕水平。血浆中Siglec-6的水平变化为临床终止妊娠是早发型重度子痫前期唯一有效的治疗手段提供了实验佐证。
　　3、Siglec-6可能通过调控PI3K-AKT信号通路，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移、促进血管内皮细胞的凋亡及炎性因子IL-6及TNF-α的分泌、抑制VEGF的分泌，导致血管内皮损伤。Siglec-6可能是诱发早发型重度子痫前期发病的关键蛋白之一。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 早发型重度子痫前期STB-EVs的分离与鉴定

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 早发型重度子痫前期STB-EVs的差异蛋白组研究

3．1 材料与方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 Siglec-6致血管内皮功能障碍的作用研究

4．1 材料与方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 滋养细胞碎片在子痫前期中的研究进展

攻读博士学位期间的研究成果

致谢