Sox30基因在小鼠和大鼠睾丸发育过程中的表达与甲基化分析

摘要

背景:
　　大量研究已经表明，表观遗传修饰改变在发育过程中起着关键作用。其中，DNA甲基化是目前研究最多和最为深入的表观遗传修饰方式之一。越来越多的证据表明，DNA甲基化主要通过调控发育过程中组织特异性基因的时空表达，维持着生物体正常的发育进程。DNA甲基化变化一旦发生异常往往与发育中出现的多种疾病状态密切相关。因此，开展发育相关基因表观遗传修饰方式的研究，有助于阐明疾病的发病机制，对深入认识相关疾病具有重要理论和现实意义。
　　Sox30(SRY-box containing gene30)作为Sox核转录因子基因超家族的成员，一直被认为只在高等脊椎动物尤其是哺乳动物中存在，而在低等脊椎动物中并不存在。而我们最近的研究表明，Sox30基因在整个动物界中普遍存在，这一发现意味着Sox30基因可能比先前认为的更加重要。已有研究显示，Sox30基因主要在睾丸生殖细胞和支持细胞中表达，可能参与了性腺发育、精原细胞分化和精予形成过程。最近，我们又首次发现Sox30基因在肺癌中是一个新的受DNA甲基化调控的肿瘤抑制基因，其作用机制是通过转录激活p53信号促进肿瘤细胞的凋亡而发挥抑制功能。然而，Sox30基因在小鼠和大鼠发育过程中的具体表达变化模式以及其表达是否受DNA甲基化调控目前还不清楚。
　　目的:
　　(1)明确Sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中表达情况;明确Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎发育全胚和发育各阶段卵巢及睾丸组织中的表达变化;
　　(2)了解Sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中的DNA甲基化发生情况，以及Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎发育和出生后发育各阶段睾丸组织中的DNA甲基化变化情况;
　　(3)确定Sox30基因在小鼠和大鼠发育过程的睾丸组织中的表达和DNA甲基化之间的关系。
　　方法:
　　(1)采用RT-PCR、RT-qPCR、WB和免疫组织化学方法检测Sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织中以及发育各阶段睾丸组织中的表达和定位情况;
　　(2)采用甲基化特异性PCR(MSP)结合亚硫酸氢盐修饰测序方法检测Sox30基因在成体小鼠和大鼠各种组织以及发育各阶段睾丸组织中的DNA甲基化情况;
　　(3)通过RT-PCR、RT-qPCR、MSP和BSP方法检测生殖系统来源的多种细胞株经过去甲基化药物（甲基化转移酶抑制剂）5-aza-C处理前后Sox30基因表达水平和DNA甲基化状态的变化情况。
　　结果:
　　(1)本研究通过检测Sox30基因在成体小鼠和大鼠的卵巢、子宫、附睾、睾丸、心脏、脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、肺、肌肉、肠、垂体、血液和海马组织中的表达谱发现，在成体小鼠，Sox30基因在睾丸组织中的表达量最高，其次是在附睾组织和肺组织中，且Sox30在睾丸组织中的表达远远高于在附睾和肺组织中的表达;在成体大鼠，Sox30也是在睾丸中的表达量最高，其次是在附睾和血液中，且Sox30在睾丸组织中的表达远远高于在附睾和血液中的表达。这些结果说明Sox30基因在小鼠和大鼠睾丸的功能维持或精子发生中具有重要作用。
　　(2)Sox30基因在小鼠和大鼠发育阶段E8.5（胚胎期8.5天）、E10.5、E12.5、E14.5、E15.5、E19.5全胚胎及1d（出生后1天）、4d、7d、10d、15d、20d、30d、40d、60d和73d的卵巢和睾丸组织中的表达分析发现，在小鼠中，Sox30在胚胎期E8.5、10.5、12.5全胚胎中表达较低，在E14.5时表达量明显升高，在从出生后1d到60d成鼠卵巢组织中都呈低表达或不表达状态，而在从出生后1d到60d成鼠的睾丸组织中表达量逐渐升高，直到60天达到峰值，并在出生后15d的睾丸组织中呈现爆发式升高，高于出生后10d时睾丸组织中的表达近30倍;在大鼠中，Sox30在胚胎期E8.5、10.5、12.5、15.5、19.5雄性和19.5雌性全胚胎中均呈低表达状态，在从出生后1d到73d成鼠卵巢组织中表达低或不表达，从出生后1d到40d大鼠的睾丸组织中表达量逐渐升高，到40天时达到峰值，以后维持在峰值水平。这些数据表明，Sox30基因在小鼠和大鼠的性别分化和睾丸发育过程中可能发挥关键作用。
　　(3)通过检测Sox30基因在小鼠睾丸中的细胞定位发现，Sox30不仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达，还在睾丸支持细胞中表达，只是在生殖细胞中的表达量高于在支持细胞中的表达。这些数据显示，Sox30基因参与了生殖细胞的发育和成熟，在睾丸发挥正常功能中具有重要作用。
　　(4)通过分析Sox30基因在成体小鼠各组织中的DNA甲基化情况发现，Sox30在卵巢、心脏、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏、肌肉和小肠组织中都是甲基化状态，而在附睾、睾丸和肺组织中则是非甲基化状态。考虑到前期的Sox30基因的组织分布表达结果，我们认为Sox30基因在成体小鼠组织中的甲基化与表达密切相关。
　　(5)通过检测Sox30基因在小鼠和大鼠发育各阶段睾丸组织中的DNA甲基化情况发现，Sox30基因在睾丸发育过程中DNA甲基化程度逐渐降低，直到发生去甲基化，而其在同时期的表达则逐渐升高，直到达到峰值。这些结果表明，Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎和睾丸发育中的表达明显受到其甲基化程度的调控。
　　(6)通过对Sox30不表达和发生甲基化的生殖系统相关细胞株进行去甲基化药物5-aza-C处理后，在Sox30发生去甲基化的细胞中，其表达得到了明显恢复。这些数据显示，Sox30基因的表达明显受到了DNA甲基化的直接调控。
　　结论:
　　在小鼠和大鼠睾丸发育过程中，Sox30基因表达与雄性性别决定时间点明显相关，同时在成体主要表达于睾丸组织而在卵巢中不表达，提示与睾丸功能以及精子发育密切相关。Sox30基因的表达受其DNA甲基化的调控，这种严格的调控模式与睾丸组织正常发育和发挥特定功能密切相关。因此，Sox30基因是一个值得深入研究的与睾丸发育相关的重要基因。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一章 前言

第二章 Sox30基因在小鼠和大鼠睾丸发育过程中的表达分析

2．1 材料和方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 Sox30基因在小鼠和大鼠睾丸发育过程中的甲基化分析

3．1 材料和方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

第四章 体外细胞实验验证Sox30表达和甲基化的调控关系

4．1 材料和方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 Sox基因在睾丸决定、分化和生殖能力维持中作用的研究进展

发表论文情况

致谢