转录共激活因子4对骨肉瘤恶性表型的影响及机制研究

摘要

目的:
　　探索PC4对骨肉瘤恶性表型的影响及其可能的分子机制。
　　首先，在前期研究基础上探索PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分期、预后的联系。
　　然后，在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞模型中检测PC4的表达情况。在高肺转移骨肉瘤细胞株143B中使用慢病毒干扰PC4的表达，检测恶性表型的变化，分析PC4可能参与哪些恶性表型的调控。
　　针对骨肉瘤肺转移表型，通过筛选分析RNA-seq结果，剖析PC4对MMP9的具体调控机制。
　　针对骨肉瘤骨破坏表型，通过筛选分析RNA-seq结果，剖析PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。
　　方法:
　　1.PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分期、预后的联系。
　　1.1 使用免疫组织化学法分析198例骨肉瘤临床标本和44例正常骨组织中PC4的表达量与年龄、性别、Enneking分期、肿瘤大小之间的关系，并对免疫组化结果进行量化评估。
　　1.2 使用WB法分析5例骨肉瘤临床标本和对应正常癌旁组织中PC4的表达量，分析PC4在骨肉瘤组织和正常组织中存在差异表达。
　　1.3 随访59例骨肉瘤病例，分析PC4的表达情况与患者生存时间之间的关系，绘制生存曲线。
　　2.通过细胞模型和裸鼠荷瘤实验，在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞株中检测PC4的表达情况。分析PC4可能参与的骨肉瘤恶性表型调控。
　　2.1 分析PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的蛋白表达情况。
　　2.2 双层软琼脂克隆实验检测7种骨肉瘤细胞的基础克隆形成能力。
　　2.3 裸鼠荷瘤实验检测多种骨肉瘤细胞的成瘤能力。
　　2.4 使用RT-PCR法在多种骨肉瘤细胞株中检测恶性表型相关基因的表达情况。
　　2.5 在143B高肺转移骨肉瘤细胞株中使用慢病毒干扰PC4的表达。
　　3.使用RNA-seq的高通量测序法，分析143B细胞株在干扰PC4后基因表达的变化情况。
　　3.1 分析143B细胞株在干扰PC4后存在差异表达的基因。
　　3.2 使用Gene ontology分析差异表达基因在不同细胞功能、细胞组成、生物学功能中的富集程度，探寻差异表达基因可能的效应。
　　3.3 使用KEGG pathway分析差异表达基因在不同信号通路中的富集程度，探寻差异表达基因可能的参与的信号通路。
　　4.针对骨肉瘤肺转移表型，基于RNA-seq结果，剖析PC4参与MMP9的调控进而影响骨肉瘤肺转移能力的机制。
　　4.1 使用PC4干扰慢病毒在7种骨肉瘤细胞株中验证慢病毒干扰效率;RT-PCR法检测7种骨肉瘤细胞株在PC4干扰后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平的变化情况。
　　4.2 使用外源性人重组FN蛋白和FNsiRNA分别在143B和MG63两种细胞模型中验证FN对MMP-2和MMP-9的调控作用。
　　4.3 使用染色质免疫共沉淀法分析PC4与MMP-9启动子区域的结合能力。
　　4.4 使用荧光素梅报告基因和PC4siRNA及SP1 siRNA，检测PC4和SP1对MMP-9基因转录激活能力。
　　4.5 免疫共沉淀法分析143B细胞中PC4蛋白与SP1蛋白的结合能力。
　　5.针对骨肉瘤骨破坏表型，基于对RNA-seq结果的分析，剖析PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。
　　5.1 裸鼠荷瘤实验检测PC4干扰前后143B细胞对骨破坏的影响。
　　5.1.1 Micro CT检测病理性骨折的发生率、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨量的变化。
　　5.1.2分别在共培养细胞模型和条件培养基细胞模型中检测PC4干扰143B细胞对RAW264.7破骨分化的影响。使用TRAP染色和骨片扫描电镜评估破骨细胞成熟程度。
　　5.1.3分析RNA-seq结果，筛选与破骨细胞活化相关的分泌型细胞因子，并使用RT-PCR法验证RNA-seq结果。
　　5.1.4使用WB法验证IGFBP5在PC4干扰前后的蛋白表达情况。
　　5.1.5使用外源性IGFBP5蛋白，检测其对RAW264.7破骨分化的影响，使用TRAP染色评估破骨细胞成熟程度。
　　5.1.6使用外源性IGFBP5蛋白，在条件培养基细胞模型中检测PC4干扰及外源性IGFBP5对RAW264.7破骨分化的影响，使用TRAP染色评估破骨细胞成熟程度。
　　结果:
　　1.PC4蛋白表达量与临床骨肉瘤分级、分期、预后的联系。
　　1.1 PC4主要在细胞核表达，在高分期的骨肉瘤标本中表达较高，PC4的表达与骨肉瘤的患者的性别、年龄无关，与肿瘤的大小以及肿瘤的Ennenking分期相关。
　　1.2 WB法检测结果提示PC4在骨肉瘤组织和配对的正常组织中存在差异表达，在骨肉瘤组织中高表达。
　　1.3 随访59例骨肉瘤病例，生存曲线分析结果提示:PC4的阳性率与患者生存时间负相关。
　　2.通过细胞模型和裸鼠荷瘤实验，在多种不同恶性程度的骨肉瘤细胞株中检测PC4的表达情况。PC4参与多种骨肉瘤恶性表型调控。
　　2.1 PC4在7种恶性程度不同的骨肉瘤细胞株中的蛋白表达情况。
　　2.2 双层软琼脂克隆实验检测7种骨肉瘤细胞的基础克隆形成能力:克隆形成能力由强到弱依次为:143B、MNNG-HOS、MG-63、9901、HOS、SAOS2、U2OS。
　　2.3 裸鼠荷瘤实验检测多种骨肉瘤细胞的成瘤能力:，143B和MNNG-HOS拥有最强的成瘤能力，9901次之，MG-63较弱，HOS在观察期内未成瘤。
　　2.4 使用RT-PCR法在多种骨肉瘤细胞株中检测恶性表型相关基因的表达情况:PC4在143B、MNNG-HOS、U2OS表达较高，HOS表达最弱;而MMP9在143B中表达异常增高，其余骨肉瘤细胞株中表达相对弱。143B的MTA1表达最高，MNNG-HOS次之，其余细胞株表达较弱。143B中P53几乎测不到表达，而HOS和U2OS相对表达最高。
　　2.5 在143B高肺转移骨肉瘤细胞株中使用慢病毒干扰PC4的表达。
　　3.RNA-seq的高通量测序法，分析143B细胞株在干扰PC4后基因表达的变化情况。
　　3.1 在143B细胞株中干扰PC4后，513个基因出现下调，571个基因上调。
　　3.2 Gene ontology分析结果提示:PC4干扰后的差异表达基因可能参与了蛋白粘附、细胞连接、细胞外基质的分泌、细胞运动、细胞应激等多种细胞生物学功能的调节。
　　3.3 KEGG pathway分析结果提示:PC4干扰后的差异表达基因在p53等20条信号通路中呈现富集状态。
　　4.PC4参与MMP9的调控进而影响骨肉瘤肺转移能力。
　　4.1 PC4干扰慢病毒在7种骨肉瘤细胞株中均有干扰效果;PC4干扰后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平除个别细胞株外均有不同程度的下调。
　　4.2 外源性人重组FN蛋白和FNsiRNA对MG63细胞的MMP-2和MMP-9均有明显调控作用，但是对143B和143BPC4-细胞的MMP-2和MMP-9没有明显的调控作用。
　　4.3 染色质免疫共沉淀法结果提示:PC4蛋白可以与MMP-9启动子区域结合。
　　4.4 荧光素梅报告基因结果提示:PC4siRNA及SP1 siRNA均可降低MMP-9的转录活性，二者存在协同效应。
　　4.5 免疫共沉淀法结果提示:143B细胞中PC4蛋白与SP1蛋白可以结合。
　　5.PC4参与骨肉瘤骨破坏的具体分子机制及可能存在的靶基因。
　　5.1 裸鼠荷瘤实验检测PC4干扰前后143B细胞对骨破坏的影响。
　　5.1.1 Micro CT检测结果提示:PC4干扰组的裸鼠病理性骨折的发生率明显降低、骨小梁数量增加、骨小梁厚度增厚、骨量增加。
　　5.1.2 共培养细胞模型和条件培养基细胞模型均提示:骨肉瘤细胞可以促进RAW264.7的破骨分化，PC4干扰可抑制该效应。
　　5.1.3 RNA-seq结果提示:在PC4干扰后CXCL2、IGFBP5、MCP1、IL1A、IL1B明显下调，RT-PCR法验证结果与RNA-seq结果一致。
　　5.1.4 WB法检测IGFBP5在PC4干扰后的蛋白表达明显下调。
　　5.1.5 外源性IGFBP5蛋白，可增加TRAP阳性细胞的数量，且该效应呈浓度依赖性。
　　5.1.6 外源性IGFBP5蛋白在条件培养基细胞模型中，可部分抵消PC4干扰对RAW264.7破骨分化的抑制作用。
　　结论:
　　1.PC4在骨肉瘤中高表达;
　　2.PC4与骨肉瘤的分期及预后存在相关性;
　　3.PC4参与调控骨肉瘤的增殖、侵袭、迁移、粘附、集落形成、成瘤、转移等恶性表型;
　　4.PC4通过与MMP9的转移因子SP1形成转录复合体，参与MMP9的转录调控;
　　5.PC4的表达量与143B细胞引起的骨吸收正相关;
　　6.干扰在143B骨肉瘤细胞中PC4的表达，可抑制143B分泌CXCL2、CCL2、IGFBP5、IL1A、IL1B，从而抑制破骨细胞的激活，降低骨肉瘤引起的骨破坏。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

前言

第一部分 PC4在人体骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤恶性程度和预后的相关性研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分 PC4对骨肉瘤恶性相关表型的调控

材料与方法

结果

讨论

第三部分 RNA-seq分析PC4干扰后143B骨肉瘤细胞株基因表达谱的改变

材料与方法

结果

讨论

第四部分 PC4调控MMP9转录的机制研究

材料与方法

结果

讨论

第五部分 PC4参与调控骨肉瘤相关骨破坏的机制研究

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

文献综述 人转录共激活因子4的研究现状

攻读学位期间发表的论文

致谢