过表达HOTAIR/mi RNA-10b促使肝正常干细胞恶性转化的实验研究

摘要

目的:
　　肝细胞癌(Hepatocellμlar carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第三大最常见原因。非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)在转录和翻译水平都发挥强大的调节功能，包括长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)和微小RNA(microRNAs miRNAs)等。miRNAs(0-22 nt)在转录后水平负调控基因表达，单个miRNAs通过互补配对和错配可以同时调控多分子。越来越多的研究表明，许多miRNAs在肿瘤发生和进展中发挥关键作用。lncRNAs（超过200nt）与miRNAs有着相似的生物学特性，即单个lncRNAs分子也可以调控单基因，多基因，家族基因，乃至整个染色体，而且还具备多种调节功能，如染色体剂量补偿、表观遗传调控、细胞核和细胞质物质运输、转录、mRNA拼接和翻译等，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等生物学行为有密切的联系。
　　正是因为具有强大的调控能力，miRNAs与lncRNAs吸引了大量研究人员来探索ncRNAs在肿瘤恶性转化中的作用。本研究团队既往的一项研究对ncRNAs在LCSCs和LNSCs间不同的表达方式进行了比较:相较LNSCs，在LCSCs中miR-200a是表达下调最多的分子之一，miR-10b是表达上调最多的分子。Geng等研究者也在HCC术后患者中发现，癌组织HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)的表达量较癌旁组织明显上升，且HOTAIR的表达量与HCC的复发和淋巴结转移关联密切，干扰HOTAIR表达后，肿瘤细胞的增殖能力明显下降。
　　miR-10b和HOTAIR的特定基因序列都位于高度保守的HOX基因簇，并且共享上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)有关目标基因的相似靶点，如HOXD10。然而，miR-10b和HOTAIR在恶性转化过程中的作用仍未知。在本研究中，通过增强HOTAIR或miR-10b在LNSCs的表达水平，来观察LNSCs向LCSCs表型恶性转化的可能性，并探索HOTAIR或miR-10b在LNSCs恶性转化进程中的作用及其调控机制，以期为LCSCs来源于分化停滞的LNSCs这一理论补充新的证据，并为HCC治疗寻找新靶点。
　　方法:
　　采用慢病毒转染原代培养的大鼠LNSCs，通过增强miR-10b或HOTAIR表达水平，对增高前后LNSCs增殖、凋亡、迁移和成瘤特性进行了观察比较，并初步探讨诱导LNSCs恶性转化的机制。
　　1.细胞收集和培养
　　利用CCL4建立大鼠肝损伤模型，切取肝脏后，采用非连续密度梯度法收集LNSCs。并根据实验要求分为miR-10b表达增强组、HOTAIR表达增强组、野生型LNSCs组。
　　2.细胞慢病毒转染
　　HOTAIR cDNA插入到哺乳动物表达载体pcDNA3.1;采用X-Press Plasmid DNAMini Kit提取用于转染的所有质粒载体;并根据Lipofectamine2000说明书，将pre-miR-10b前体(50nm)和pCDNA/HOTAIR分别形成DNA-Lipofectamine2000复合物，将复合物转染293T细胞，扩增培养并破解293T细胞收集含有目标基因的慢病毒，最后通过浓缩的慢病毒感染靶细胞LNSCs。
　　结果:
　　1.miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs增殖能力增强
　　慢病毒转染后的头3天，miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组细胞增殖都比较缓慢，这段时期所有的细胞都被认为处于潜伏期。第4天开始， miR-10b和HOTAIR表达增强组LNSCs细胞数远高于野生型LNSCs组。第3天至第5天，miR-10b和HOTAIR表达增强组LNSCs细胞均进入对数生长期，比野生型LNSCs有着显著更高的增殖速度和更短的倍增时间。miR-10b和HOTAIR表达增强组之间在增殖能力方面没有观察到显著差异。实验结果表明:miR-10b或HOTAIR表达增强后细胞增殖能力增强。
　　2.miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs在S和G2/M期的细胞增多，凋亡减少
　　各组的大部分细胞处于G1期。野生型LNSCs组，约12％的细胞处于G2/M期，4％处于S期。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组分别约19％和23％的细胞处于G2/M期，约14％和17％的细胞分别处于S期。实验结果表明:miR-10b或HOTAIR的表达增强能显著减少处于细胞周期G0/G1期的细胞比例，增加处于S和G2/M期的细胞比例。
　　在野生型LNSCs组、miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组中，坏死细胞比率分别约为9％，7％和2％，细胞凋亡率分别为11％，9％和2％。实验结果表明:miR-10b或HOTAIR表达增强后细胞抗凋亡能力显著提高。
　　3.miR-10b或HOTAIR表达增强对AFP、CK19产生影响
　　随着miR-10b和HOTAIR表达增强后LNSCs的恶性转化，甲胎蛋白AFP表达上调，而胆管细胞的标记CK19表达逐渐消失。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组AFP的特定表达水平分别比野生型LNSCs组高3.1倍和2.9倍。实验结果表明:LNSCs恶性转化的趋势是肝细胞癌，而不是胆管细胞癌。
　　4.miR-10b或HOTAIR表达增强后LNSCs获得更强的迁移能力
　　在相同的培养条件下，miR-10b或HOTAIR表达增强的LNSCs比野生型LNSCs具有明显更高的穿膜力。miR-10b表达增强组和HOTAIR表达增强组阳性细胞数相近。实验结果表明:miR-10b或HOTAIR表达增强后，细胞具有更强的迁徙特性。
　　结论:
　　1.发现了非编码RNA中miR-10b和HOTAIR参与了肝正常干细胞向肝癌干细胞恶性转化的过程;
　　2.发现了增强miR-10b或HOTAIR表达水平能够诱导肝正常干细胞出现肝癌干细胞的一系列恶性表型，如增殖加快、凋亡减少、迁移能力增强，并出现归巢倾向;
　　3.初步证明了miR-10b或HOTAIR可以通过下调E-钙粘蛋白和诱导EMT发生，促使肝正常干细胞发生恶性转化。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 肝干细胞的分离培养和慢病毒转染

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 miRNA-10b或HOTAIR表达增强对肝干细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 miRNA-10b或HOTAIR表达增强对肝干细胞体内成瘤能力的影响

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 miRNA-10b或HOTAIR表达增强促使肝干细胞恶性转化部分机制的探讨

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

5．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读博士期间发表的论文

致谢