美洲大蠊肠道内生放线菌的多样性研究

摘要

在细菌耐药日趋严重的今天，加强新药研发具有非常重要的现实意义。放线菌是新型抗菌药物的重要来源。长期以来，研究放线菌天然药物的重点多集中在土壤放线菌。但是，随着土壤放线菌资源开发利用日趋达到极限，从中发现新药物或先导化合物的几率大大降低，分离的活性代谢产物95％以上都是已知化合物。因此，拓宽放线菌研究领域，从不同来源的生物中寻找新的放线菌资源，是必由之路。自上世纪60年代起，海洋微生物和中药植物内生菌逐渐成为新药研发的热点。迄今为止，已从中发现了近两万种天然产物，而有关昆虫微生物天然产物的研究只见零星报道。昆虫是自然界最大的生物种群，约占全物种的85%以上，生命力非常顽强，大量内生菌与昆虫互惠共生、协同进化、抵抗致病菌入侵。美洲大蠊是传统中药材，具有抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、保肝、促进组织修复及抗炎、镇痛等作用。美洲大蠊存在地球2亿多年，仍生生不息，现已成为室内的优势种群，主要生活在厨房、厕所、浴室及下水道等阴暗潮湿的环境。现代医学对美洲大蠊药理作用的研究越来越多，但有关美洲大蠊内生放线菌多样性及其应用方面的研究还较少。本文拟系统研究美洲大蠊肠道内生放线菌的多样性，为充分认识其药用价值和生物特性奠定基础。
　　研究目的:
　　以野生美洲大蠊为研究对象，分离其肠道内生放线菌。采用形态学和分子生物学等方法进行初步分类鉴定及系统发育学分析，并对从美洲大蠊肠道分离得到的13株内生戈登氏放线菌的生理生化特性进行了初步研究。通过对美洲大蠊肠道内生放线菌生物多样性的研究，期望为新药研发提供新的微生物资源。
　　研究方法:
　　1.美洲大蠊肠道内生放线菌的分离鉴定:
　　选择适宜的抑菌剂，采用平板划线稀释法分离美洲大蠊肠道内生放线菌。通过形态观察、16S rDNA扩增产物Blast序列比对和DNAman6.0序列比对进行初步的分类鉴定，运用Mega5.1软件，采用最大似然值法，构建系统发育树对其进行分析。
　　2.13株内生戈登氏放线菌的生理生化特性研究
　　通过形态观察、16S rDNA扩增产物Blast序列比对和DNAman6.0序列比对13株戈登氏放线进行分类鉴定，运用Mega5.1软件，采用最大似然值法，构建系统发育树对其进行分析。运用GenBank中的BankIt软件，申请13株戈登氏放线菌基因序列号。在此基础上，以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)、大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumonica)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）等5种细菌和白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)、黑曲霉（Aspergillus nige,A.nige）、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)等4种真菌为供试菌，检测13株内生戈登氏放线菌发酵液的初步抑菌活性。并通过碳源利用实验、纤维素降解实验、淀粉降解实验、生物大分子降解实验、杀虫剂主要活性成分降解实验和重金属离子吸附实验等研究其理化性质。
　　实验结果：
　　1.从13只美洲大蠊肠道中共分离得到了159株内生放线菌，形态特征符合放线菌的经典特征。16S rDNA扩增产物Blast序列比对结果显示，159株内生放线菌分属10个科，12个属，其中链霉菌属和戈登氏放线菌属是优势菌属，分别占分离总数的67.3%、8.2%。DNAman6.0序列比对结果显示，149株放线菌与已知放线菌的相似度低于98.2%，占总分离菌株数的93.7%，可能是新菌株。
　　2.DNAman6.0序列比对结果显示13株内生戈登氏放线菌与已知菌株的相似性均低于98.2%，可能为新的菌种。经申请，共有8株戈登氏放线菌的基因序列号。生理生化特性实验结果显示，有4株戈登氏放线菌的发酵液对S.aureus有抑制作用，4株对MRSA有抑制作用，4株对E.coli有抑制作用，8株对B.subtilis有抑制作用；3株对C.albicans有抑制作用，2株对T.rubrum有抑制作用，对K.pneumonica和A.fumigatus有抑制作用的只有1株，没有发现对A.nige有抑制作用的菌株；13株戈登氏放线菌均能吸收利用葡萄糖和蔗糖，均不能吸收果糖和甘露糖，部分能吸收木糖、肌醇和鼠李糖；13株内生戈登氏放线菌均能降解纤维素和水解淀粉，但降解和水解能力均不强；13株内生戈登氏放线菌对铜、铅、汞等重金属离子具有较强的吸附作用，对芘、蒽、菲等生物大分子具有较强的降解作用，对氧乐果、残杀威、高效氯氰菊酯、吡虫啉、氟虫胺等杀虫剂主要活性成分具有较强的降解作用。
　　结论：
　　美洲大蠊肠道内存在丰富的放线菌资源，有望为新药研发和环境治理等提供新的微生物资源。

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中文摘要

英文摘要

第一章 序言

1.1 昆虫内生菌研究概况

1.2 放线菌研究概况

1.3 戈登氏放线菌研究概况

1.4 研究目的与意义

第二章 美洲大蠊肠道内生放线菌的分离鉴定

2.1 前言

2.2 材料与仪器设备

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 小结与讨论

第三章 13 株内生戈登氏放线菌的生理生化特性研究

3.1 前言

3.2 材料与仪器设备

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 小结与讨论

全文总结

研究展望

参考文献

附录1 英文缩写语中文对照

攻读学位期间科研情况

致谢