新型雷帕霉素微粒释药系统的构建及其抗动脉粥样硬化作用研究

摘要

心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是导致人类死亡和劳动力丧失的重要因素，其发病率和死亡率已经超越肿瘤位居第一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是引起冠状动脉疾病、中风等多种心血管疾病的共同的病理基础，是当前人类需要攻克的一大难题。AS的发病机制较为复杂，致病因素较多，目前以他汀类为代表的降脂药物被广泛应用于临床治疗，尽管取得了一定效果，但是CVD的发病率和致死率依然逐年上升，同时长期给药带来的不良反应也对患者造成较大困扰，因此寻找有效的治疗药物、构建适宜的药物递送系统对于防治CVD具有重要意义。
　　雷帕霉素(Rapamycin，RAP)因具有良好的抗增殖活性被广泛用于器官移植后抗排斥反应和抑制冠状动脉支架植入术后再狭窄。RAP的靶点为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin，mTOR)，它是调节细胞内脂质、蛋白、能量水平的重要因子。通过调节mTOR信号通路，RAP具有抗炎、抑制平滑肌细胞增生、迁移和促进自噬选择性杀灭巨噬细胞等多重作用，因而具有潜在的抗AS作用。目前对于RAP在动物体内抗AS作用还不明确，其AS防治作用有待进一步确证。另一方面，RAP较强的疏水性导致其传统剂型给药后生物利用度低，不利于其疗效的发挥。同时，RAP的传统剂型在释放时间和释放位点两个方面的控制均不理想，限制了其疗效的发挥，亦会带来较大的不良反应。因而，构建适用于不同给药途径的、具有良好临床应用前景的新型RAP释药系统，对于发挥RAP的有效活性意义重大。
　　目的：
　　构建不同的RAP微粒释药系统，以为其疗效的最大化发挥提供潜在的新型药物制剂。为此，首先在小鼠体内评价了RAP的抗AS作用;然后，通过主-客体作用介导的自组装方法构建了RAP口服微粒系统，通过缩醛化β-环糊精材料构建了适用于局部注射给药的RAP缓释微粒，并通过具有病灶微环境响应性的功能化β-环糊精材料构建了靶向性RAP纳米释药系统。与传统的RAP制剂相比，这些不同的释药系统各具优势，并能更好地发挥RAP的抗AS作用，为其临床防治AS的应用奠定了坚实的基础，同时也为RAP的临床应用提供了多种新型的候选剂型。
　　方法：
　　1.载体材料的合成
　　1.1.聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)的合成
　　1.2.缩醛化β-环糊精(Ac-bCD)的合成
　　1.3.氧化响应性β-CD(Ox-bCD)的合成
　　上述制备的材料均通过氢核磁共振光谱法(1H NMR)和傅立叶变换红外光谱法(FTIR)确证其结构，凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量。
　　2.载药微粒的制备
　　2.1.口服微粒系统的制备
　　2.2.RAP缓释微粒的制备
　　2.3.响应性RAP载药纳米粒的制备
　　3.载药微粒的表征
　　称取少量样本分散于水中，吸取足量混悬液滴于铜网膜和云母片上，室温挥干，分别进行透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察。将剩余混悬液稀释后加入比色杯中，通过动态光散射法测定样品的粒径大小及其分布。另称取少量样本溶于DMSO中，紫外分光光度计法(UV)或液相色谱法(HPLC)测定RAP的含量，计算其载药量和包封率。
　　4.药物与载体材料间分子作用力的研究
　　通过计算模拟分析RAP与载体材料PNIPAm间的相互作用，采用MOE软件生成RAP、PNIPAm三维构象，从Zinc数据库中下载得到IND构象，应用MMFF94x力场进行能量最小化分析，采用Autodock对PNIPAm、RAP、IND和水分子之间的相互作用力进行两两或者多分子对接，采用LGA算法计算分子间结合能大小。
　　5.RAP载药微粒的体外释放动力学研究
　　称取适量载药微粒混悬于不同pH值的PBS或含有H2O2的PBS中，置于37℃孵箱中，不同时间点离心后取出部分释放液，再分散后加入同等体积的新鲜溶液。测定药物浓度，Origin软件绘制药物累积释放曲线。
　　6.载药微粒的体内药动学研究
　　7.AS模型的建立及不同治疗方案
　　8.主动脉斑块面积分析
　　9.主动脉切片的组化分析
　　10.小鼠血清中炎症因子的测定
　　11.RAP对mTOR信号通路的作用研究
　　12.主动脉组织ROS水平的测定
　　13.响应性纳米粒靶向AS斑块的评价
　　14.微粒释药系统的初步安全性评价
　　结果：
　　1.通过自由基聚合合成了PNIPAm，GPC测得其分子量为53973。采用MP为缩醛化试剂，通过动力学控制的缩醛化反应成功合成了缩醛化β-CD(Ac-bCD)，其中线性与环状缩醛基团的摩尔比为0.62∶1;通过将PBAP化学键合于β-CD，制备得到了氧化响应性的β-CD材料(Ox-bCD)，其中每个β-CD单元含有11个PBAP单元。
　　2.基于IND或SUL介导的PNIPAm的自组装成功将RAP负载于微粒中，得到平均粒径在600-800 nm的载药微粒;其载药量随着投药比的增加而升高，最高接近60％;通过乳化法制备的PLGA和Sl00载药微粒，平均粒径在600 nm，其RAP载药量分别为18.1％和17.2％。分子间动力学模拟结果表明RAP、IND、PNIPAm之间存在疏水作用，氢键作用、范德华力和静电作用，因此能够克服RAP分子间自身的结晶力，使RAP以无定型的形式被包裹于聚合物中，从而更有利于药物的溶出，提高其体内生物利用度。
　　3.采用水包油乳化法成功将RAP包裹于Ac-bCD微粒中得到RAP-NP，其平均粒径为250nm，载药量27.2％，SEM和TEM观察表明RAP-NP呈规则球状，且分散均匀。
　　4.以PLGA、Ac-bCD和Ox-bCD分别为疏水载体材料，采用纳米沉淀-自组装法成功制备得到具有不同响应性的RAP纳米粒，即RAP/PLGA NP、RAP/Ac-bCD NP和RAP/Ox-bCD NP，三种纳米粒的平均粒径均在250nm左右，载药量分别为8.0％、12.5％和7.0％，SEM和TEM观察表明，纳米粒均呈规则球形、分散均匀。
　　5.体外释放实验表明，在pH7.4的PBS中，载RAP的PLGA和S100微粒24小时药物累积量为50％，而自组装RAP/PNIPAm微粒同时间段的释放量为70％。体内药动学研究表明，自组装RAP微粒组具有显著增加的口服生物利用度，其血药浓度-时间曲线下面积(AUC)是PLGA和S100微粒的2倍。
　　6.在pH7.4的PBS中，RAP-NP能够持续释放32天，且是要速率较为恒定;在小鼠体内，RAP-NP皮下注射后可持续释放22天，其血药浓度长时间维持在50 ng/L。与此对应，小鼠皮下注射RAP-NP能够长时间保持主动脉组织中RAP的浓度在1.2ng/g。
　　7.PAP/Ac-bCD NP的释放具有明显的pH依赖性，其在pH5的释放速率显著快于pH7.4对应的释放速率。另一方面，PBS中加入1 mM H2O2能够显著加速RAP/Ox-bCD NP的释药，表明其具有较好的氧化响应性。微酸性条件和H2O2的存在对RAP/PLGA NP的体外释放无明显影响。
　　8.ApoE/-小鼠高脂喂养三个月后，对照组主动脉窦附近能够形成肉眼可见的白色斑块，表明AS模型建立成功。与对照组相比，RAP原料药能够明显抑制AS斑块的生长，降低斑块内巨噬细胞和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平、升高斑块外周胶原含量，从而提高斑块稳定性。
　　结论：
　　1.口服后，高剂量的RAP原料药能够有效抑制ApoE-/-小鼠AS斑块的生长、提高斑块的稳定性，表现在主动脉斑块面积的减小、斑块内巨噬细胞和MMP-9水平的降低、以及斑块外周胶原含量的升高。
　　2.通过含羧基小分子化合物介导的PNIPAm的自组装，可以制备RAP载药微粒，实现RAP的高效负载;同时因各分子间作用力大于药物分子结晶力，使得RAP分子以无定形状态包裹于微粒中，因而具有良好的药物溶出度，口服给药后比对照微粒系统具有更高的生物利用度。与此对应，自组装RAP微粒比同剂量的PLGA和S100微粒具有更有效的抗AS作用。因此，自组装RAP微粒有望为RAP的临床应用提供一种理想的口服制剂。
　　3.通过缩醛化反应成功制备了新型载体材料Ac-bCD，采用水包油乳化法制备得到具备优越缓释性能的RAP-NP，它能维持血药浓度长时间稳定在较低水平，在这种药物作用方式下RAP-NP能够选择性抑制mTORC1;原料药因其较高的血药浓度能够同时抑制mTORC1和mTORC2信号通路。与口服RAP原料药相比，RAP-NP缓释微粒具有更加优异的抗AS作用。
　　4.通过将氧化敏感性的基团化学键合于β-CD成功制备了新型氧化敏感性载体材料Ox-bCD。通过纳米沉淀-自组装法制备可以制备具有不同响应性的RAP载药纳米粒，其中RAP/Ac-bCD NP和RAP/Ox-bCD NP分别具有微酸性和氧化响应性释药性能。活体成像结果表明，腹腔注射后纳米粒能够靶向于主动脉斑块部位。与对照PLGA载药纳米粒相比，微环境响应性的RAP/Ac-bCD和RAP/Ox-bCD纳米释药系统具有显著增强的的抗AS作用。

目录

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英文缩写词表

摘要

第一章 前言

第二章 口服雷帕霉素自组装微粒系统的构建及其抗动脉粥样硬化作用研究

2．1 雷帕霉素／聚(N-异丙基丙烯酰胺)自组装微粒的制备及其表征

2．1．1 材料和方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．2 药物-载体材料分子间作用力的动力学模拟

2．2．1 材料和方法

2．2．2 实验结果

2．2．3 讨论

2．3 雷帕霉素／聚(N-异丙基丙烯酰胺)自组装微粒的体内外释放行为研究

2．3．1 材料和方法

2．3．2 实验结果

2．3．3 讨论

2．4 雷帕霉素／聚(N-异丙基丙烯酰胺)自组装微粒的体内药效学评价

2．4．1 材料和方法

2．4．2 实验结果

2．4．3 讨论

2．5 雷帕霉素／聚(N-异丙基丙烯酰胺)自组装微粒的安全性评价

2．5．1 材料与方法

2．5．2 实验结果

2．5．3 讨论

2．6 载体材料聚(N-异丙基丙烯酰胺)的初步体内长期毒性评价

2．6．1 材料与方法

2．6．2 实验结果

2．6．3 讨论

2．7 小结

第三章 雷帕霉素缓释微粒系统的构建及其抗动脉粥样硬化研究

3．1 雷帕霉素缓释微粒的制备及其表征

3．1．1 材料与方法

3．1．2 实验结果

3．1．3 讨论

3．2 雷帕霉素缓释微粒的体内外释放行为研究

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．3 雷帕霉素缓释微粒的体内药效学评价

3．3．1 材料与方法

3．3．2 实验结果

3．3．3 讨论

3．4 雷帕霉素缓释微粒抗动脉粥样硬化的初步机制探索

3．4．1 材料与方法

3．4．2 实验结果

3．4．3 讨论

3．5 雷帕霉素缓释微粒系统的初步体内安全性评价

3．5．1 材料与方法

3．5．2 实验结果

3．5．3 讨论

3．6 全章小结

第四章 病灶微环境响应性雷帕霉素纳米粒的制备及其抗动脉粥样硬化作用研究

4．1 微环境响应性雷帕霉素纳米粒的制备及其表征

4．1．1 材料与方法

4．1．2 实验结果

4．1．3 讨论

4．2 细胞对纳米粒的摄取行为研究

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．3 纳米粒对动脉粥样硬化斑块的靶向特性研究

4．3．1 材料与方法

4．3．2 实验结果

4．3．3 讨论

4．4 响应性雷帕霉素纳米粒抗动脉粥样硬化作用的评价

4．4．1 材料与方法

4．4．2 实验结果

4．4．3 讨论

4．5 响应性载药纳米粒的初步体内安全性评价

4．5．1 材料与方法

4．5．2 实验结果

4．5．3 讨论

4．6 全章小结

全文总结

参考文献

文献综述 纳米医学在心血管疾病诊断与治疗中的研究进展

在读期间发表文章

致谢