幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)胞外黏附相关结构域的三维结构测定

摘要

幽门螺杆菌（Helicobαcter pylori，H.pylori）选择性地定植于宿主胃窦上皮细胞表面和胃黏液的底层，使感染得以建立和持续，细菌表面的多种膜外蛋白参与了这种定植作用。幽门螺杆菌黏附素A(H.pylori adhesin A，HpaA)是位于H.pylori鞭毛鞘或细菌表面的一种膜外蛋白，近年来，作为一种重要的保护性抗原广泛被用于疫苗设计。HpaA属于神经氨酰乳糖结合凝集素前体(Neuraminyll actose-binding hemagglutininprecursor, NLBH)家族，为定植于消化道的螺旋杆菌属所特有，结合胃肠道上皮细胞含唾液酸基团的大分子受体。然而，关于NLBH家族成员的文献报道极少，这类蛋白的结构和功能并不明确，自1988年首次被文献报道以来，HpaA介导黏附与定植的功能及作用机制尚未被证实，与之相结合的胃上皮细胞受体也未被鉴定。
　　本课题的目的是解析HpaA晶体结构。目的蛋白全长260位氨基酸，考虑到纯化和结晶的可行性，根据生物信息学分析结果，不表达蛋白跨膜区，并去除一些可能影响蛋白质结晶的柔性区域，仅表达蛋白羧基端胞外黏附相关结构域。克隆了H.pylori标准株26695的hp0797基因不同长度片段，构建pET22b(+)-rHpaA36、pET22b(+)-rHpaA31、pET22b(+)-rHpaA53三种重组质粒，分别表达36-260位、31-260位、53-260位氨基酸的三种长度重组蛋白，为便于纯化，羧基端带6×His标签。三种蛋白均能在E.coli BL21(DE3)菌株中高效上清表达，纯化后的蛋白以二聚体形式存在于缓冲液中，纯度95％以上，但最后仅rHpaA53分别在硫酸锂、硫酸铵沉淀剂条件下获得的两种晶体衍射分辨率较高。
　　在硫酸锂条件下生长的晶体大小约800×280×60μm，衍射分辨率2.03(A)，属六方晶系，晶胞参数α=b=95.33(A)，c=54.81(A)，γ=120°，P65空间群，一个不对称单位中含1个分子，结合4个硫酸根离子，但缺失198-213位氨基酸的电子密度。在硫酸铵条件下生长的晶体大小约70×70×30μm，衍射分辨率2.6(A)，属正交晶系，晶胞参数α=106.31(A)，b=121.008(A)，c=190.56(A)，P22121空间群，一个不对称单位中含8个分子，除首、尾几个氨基酸外，电子密度无缺失，解析出完整的rHpaA53蛋白结构。
　　对HpaA胞外结构域的晶体结构解析为理解HpaA及NLBH家族发挥黏附作用的功能奠定了基础，并为寻找更有效的表位以辅助疫苗研发、或通过干预黏附作用来预防和治疗H.pylori感染提供了线索。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 HpaA的克隆、表达及纯化

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 HpaA晶体生长及优化

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 HpaA三维结构解析

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 幽门螺杆菌黏附相关蛋白研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢