紫花地丁一种新型环肽的制备工艺及功能研究

摘要

本课题主要内容为大环肽241b的重组表达、纯化工艺与生物功能的研究。涉及对目的大环肽241b的表达与富集、包涵体处理条件与大环肽纯化过程优化；采用抑菌试验、细胞实验和秀丽隐杆线虫等不同方法检测目的大环肽具有的生物学功能；对大环肽发酵过程中质量控制及对污染菌株进行鉴定，并基于秀丽隐杆线虫检测其对241b生物学活性的影响。通过对上述几方面内容研究，获得如下结果：
　　1、在实验室前期表达优化后的基础上，获得可溶性目的大环肽241b。并对沉淀包涵体中目的大环肽的释放条件进行优化，获得一组包涵体释放的工艺条件，即：使用8 mol/L的尿素溶解包涵体后，获得的上清液在含有1mmol/L GSH，0.1mmol/L GSSG，0.8mmol/L L-Arg的透析液中，于25℃条件下进行梯度透析，最终每克包涵体可获得约1.4 mg大环肽。
　　2、采用C18固相萃取对可溶性蛋白进行脱盐处理，70％ACN进行洗脱；脱盐后大环肽经程序为：0-5min（88%A相：5%ACN+0.05%TFA，12%B相：90%ACN）；5.01-10min（40%A相，60%B相）；10.01-30（10%A相，90%B相）；30-30.10（88%A相，12%B相）；30.10-40（88%A相，12%B相）的RP-HPLC进行洗脱；经MOLDI-TOF-MS鉴定所得目的大环肽为241b。
　　3、MIC法测定大环肽241b对G-菌，大肠杆菌、绿脓杆菌最小抑菌浓度分别为0.2、1.0mg/mL；对 G+菌枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.2mg/mL。CCK-8法检测241b在低浓度时对MCF-7生长具有促进作用，高浓度具有抑制作用：C241b=0.03mg/mL时，较对照组细胞活性增加38.44%；C241b=1mg/mL时达到最大抑制效果，达95%，IC50值为0.225mg/mL。当241b与CdCl2共同作用于MCF-7时，展现出明显的不规律性，说明两者在适当的浓度条件下可发生络合作用。对L1秀丽隐杆线虫饲喂241b培养48h，C241b=0.5mg/mL时，对线虫生长抑制效果达100%；浓度为1mg/mL时，线虫全部死亡。当C241b=0.05mg/mL时，线虫中值寿命降低36.36%；随着大环肽浓度的增加而逐渐减少；当C241b=2mg/mL时，中值寿命降低90.9%；继续增加大环肽浓度，已无明显影响。该结果说明大环肽对线虫的生长具有较强的抑制作用。
　　4、对比相同条件下，摇瓶和搅拌式发酵罐发酵方式对大环肽的产量影响。优化条件后，确定：241b菌液接种量为5%，加入葡萄糖终浓度为10g/L LB中，培养至OD600≈1.2时，IPTG诱导表达8h后，摇瓶与发酵罐中菌体量分别为3.5g/L和5.38g/L，菌体质量提高了34.76%；包涵体中目的蛋白含量减少30.43%；最终摇瓶中每升发酵液可获得44.91mg大环肽241b，而发酵罐中可获得68.57mg，产量提高34.5%。说明在原有表达条件基础上进一步扩大培养，可提高大环肽产量。
　　5、采用16S rDNA技术，鉴定污染的241b保存菌种241b-5和241b-7为粘质沙雷氏菌的两个亚型。基于秀丽隐杆线虫模型，检测其对241b生物学活性影响。发现单独添加241b-5、241b-7时，均会降低线虫的生长速率、寿命及身体摆动频率；而与241b-1混合添加时，两者对线虫的生长速度均具有明显影响，而对头部摆动频率影响较小；且241b-5与241b-1菌液混合时对线虫寿命的影响与241b-1无明显差别；当241b-7与241b-1混合时，线虫寿命相比于241b-1单独添加时降低了16%。为保证发酵质量，应在实验操作过程控制好实验卫生条件。
　　综上所述，本文通过重组表达技术获得具有生物活性的大环肽，为重组大环肽的工业化生产提供了理论依据，也为本实验室后期突变体库的构建奠定了基础。

目录

声明

前言

1.1多肽类药物研究现状

1.2大环肽

1.3课题内容

第一章 可溶性大环肽241b获得与纯化工艺

1.1材料

1.2实验方法

1.3 结果与分析

1.4本章小结

第二章 大环肽241b生物活性功能检测

2.1材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4本章小结

第三章 两种不同发酵方式比较

3.1材料

3.2实验方法

3.3 结果与分析

3.4本章小结

第四章 发酵质量控制

4.1材料

4.2 方法

4.3结果与分析

4.4 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

科研成果

附录一 中英文缩略词对照

附录二 MOLDI-TOF-MS相关数据

附录三 16S rDNA测序结果