丙烯酰胺母源性暴露对母鼠大脑髓鞘毒性和对仔鼠髓鞘化的影响

摘要

丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一种常见的化工原材料，广泛应用于采矿业、造纸业、纺织业、污水处理、土壤调节和科研实验等多种领域。一般来说聚丙烯酰胺没有毒性，但动物实验已证实单体ACR具有神经毒性、生殖毒性、遗传毒性和致癌性等。目前已经在人体发现其神经毒性，主要表现为肢体乏力、共济失调、感觉过敏等一系列的临床症状。一直以来，关于中枢神经系统疾病的研究主要集中在大脑皮质。近些年来的研究显示，白质的病变与很多中枢神经系统疾病密切相关。由于白质血管分布比较少，白质比大脑皮质更容易受到损伤。有研究显示，脑白质损伤的患儿脑瘫发生率可增加15倍。
　　孕哺期是女性的特殊生理时期，由于抵抗力下降，对各种有害因子更加敏感。可能与激素水平改变有关，女性在产后3个月内大脑脱髓鞘改变发生率较高。近年来由于围产技术的提高，新生儿的存活率增加，但小儿神经系统疾病亦呈增加的趋势。婴幼儿处于生长发育关键时期，由于各器官功能尚未发育完善，更容易受到各种因素的干扰而增加发生多种小儿脑病的风险。关于ACR对孕哺期母婴脑白质或髓鞘的毒性作用，至今在国内、外的研究报道较少。关注ACR对这两种特殊群体髓鞘的影响，有利于保障母婴双方的健康，提高生育质量。
　　为此，我们拟建立SD大鼠ACR母源性暴露的模型，通过免疫组织化学法、western免疫印迹法、坚牢蓝染色和透射电镜等技术，研究ACR对母鼠髓鞘的神经毒性和对仔鼠髓鞘发育的影响。由于髓鞘是少突胶质细胞的突起缠绕在神经元轴突所形成，是神经元发育的重要组成部分，本实验进一步检测ACR染毒对仔鼠神经元和突触形成与发育的影响。
　　方法：
　　1.动物模型的建立：SPF级SD大鼠，雌鼠40只，其中备用雌鼠8只，雄鼠16只，均为6周龄鼠，体重180-200g。适应性饲养6周后，随机以1:1的比例雌雄大鼠同笼交配，逐日早晨检查阴栓，查到阴栓，则确认交配成功，并定当天为妊娠第0天。将孕鼠随机分为四组，每组8只，于妊娠第15天开始灌胃给药，实验组给予ACR剂量分别为4.5mg/kg，9mg/kg，18mg/kg，对照组给予同等剂量的双蒸水，连续给药至仔鼠出生后第14天（出生当天为第0天）。每窝幼鼠在出生后第3天称重并都随机保留10只，分别在出生后第7天和第14天各取材5只。
　　2.检测ACR对母鼠髓鞘的毒性作用：母鼠行为学检测；Nissl染色检测母鼠皮质尼氏小体的变化；HE染色检测母鼠胼胝体结构的变化；LFB染色检测母鼠胼胝体脂类的表达情况；免疫组织化学法和western免疫印迹法检测母鼠胼胝体GFAP、PLP和MBP蛋白的表达。
　　3.检测ACR对仔鼠髓鞘化的影响：仔鼠行为学检测；LFB染色检测仔鼠白质脂类的表达情况；免疫组织化学法和免疫荧光法检测P7、P14仔鼠内囊和胼胝体髓鞘相关蛋白PLP、MBP的表达情况；western免疫印迹法定量分析P7、P14仔鼠大脑PLP、MBP蛋白的表达情况；透射电镜观察P14仔鼠大脑额叶皮质下白质髓鞘的结构。
　　4.检测ACR对仔鼠神经元和突触发育的影响：通过免疫组织化学法检测P14仔鼠海马区域DCX、GAP-43、GFAP的表达；western免疫印迹法检测仔鼠大脑DCX、SYP、GFAP的表达情况；透射电镜观察仔鼠额叶皮质突触的结构。
　　结果：
　　1.ACR对母鼠的影响：ACR染毒结束后，与对照组和低剂量组母鼠相比较，中、高剂量组母鼠步态得分明显增加（P＜0.01）；与对照组相比较，高剂量组母鼠产后体重明显下降（P＜0.05）；Nissl染色显示，高剂量组母鼠皮质尼氏小体减少、变小；HE染色显示高剂量组胼胝体较对照组小，内部组织疏松改变；ACR各剂量组母鼠LFB染色变浅；免疫组织化学方法和western免疫印迹法检测结果显示，与对照组相比较，低、中、高剂量组母鼠大脑GFAP的表达显著增加（P＜0.01）；与对照组相比较，中、高剂量组母鼠大脑髓鞘蛋白PLP和MBP的表达均明显比对照组少（P＜0.05）。
　　2.ACR对仔鼠大脑髓鞘化的影响：与对照组相比较，高剂量组仔鼠存活率明显下降（P＜0.05），P0、P7、P14高剂量组仔鼠体重均明显降低（P＜0.05）；对照组仔鼠LFB染色呈亮蓝色，ACR染毒后染色变浅甚至消失；免疫组织化学检测和western免疫印迹法结果显示，ACR染毒后P0、P7、P14各剂量组仔鼠大脑髓鞘蛋白PLP和MBP表达皆有下降，其中，中、高剂量组与对照组相比表达下降比较明显（P＜0.05）；透射电镜下P14高剂量组仔鼠成熟髓鞘数量减少，髓鞘板层排列紊乱，板层之间出现松解分离，甚至形成囊泡样改变。
　　3.ACR对P14仔鼠神经元和突触的影响：免疫组织化学法结果显示，P14仔鼠海马齿状回DCX、GAP-43、GFAP阳性表达均较对照组明显减少（P＜0.05）；western免疫印迹法结果显示，与对照组相比较，高剂量组仔鼠大脑DCX、SYP、GFAP的阳性表达均显著下降（P＜0.05）；透射电镜下，对照组仔鼠大脑额叶皮质突触数量较多、染色深、细胞结构清晰，高剂量组突触数目少、着色浅、细胞结构不清晰。
　　结论：
　　1.ACR母源性暴露后母鼠和仔鼠均出现了神经毒性反应；
　　2.ACR染毒后母鼠胼胝体脂类、PLP和MBP的表达均减少，可能是导致胼胝体组织结构疏松改变的原因；
　　3.ACR减少仔鼠大脑脂类、PLP和MBP的表达，可能是导致仔鼠大脑髓鞘化延迟的原因之一；
　　4.ACR减少仔鼠大脑SYP、DCX、GAP-43以及GFAP的表达，可能干扰了神经元和突触的发育。

目录

中英文缩写语对照表

第一章 序言

1.1 研究背景

1.2 研究目的、意义

1.3 研究内容

1.4 技术路线

第二章 丙烯酰胺染毒对孕哺期母鼠胼胝体髓鞘的毒性作用

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 丙烯酰胺母源性暴露对仔鼠大脑髓鞘化的影响

3.1 前言

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 丙烯酰胺母源性暴露对仔鼠神经元和突触发育的影响

4.1 前言

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的文章

致谢