LPS拮抗剂苦柯胺B介导LPS在肝脏内化清除的分子机制研究

摘要

研究背景与目的：脓毒症（sepsis）是病原体（PA）感染机体后，因PA所释放的病原体相关分子模式(PAMPs)被体内的模式识别受体（PRRs）识别所引发的失控性炎症反应综合症；在PAMPs中，存在于革兰阴性细菌外膜的脂多糖/内毒素（LPS）是至今研究最为深入的一种PAMP，是诱发脓毒症的重要PAMP。因此研究针对LPS的拮抗和清除机制，对脓毒症的预防和治疗具有重要意义。
　　苦柯胺B（KB)是课题组在前期研究中从传统中药地骨皮中发现、分离并已实现全化学合成的一种生物碱类化合物，KB在体内外具有中和LPS的致炎生物学效应，可显著提高脓毒症模型动物的生存率，该化合物现已完成Ⅰ期临床试验。KB拮抗脓毒症的作用机制在于与LPS具有高亲和力的结合作用，这种结合作用使其与LPS结合并形成KB/LPS复合物后，从而阻断了LPS的致炎生物学效应，但所形成的KB/LPS复合物在体内是如何分布、代谢以及有无蓄积的可能性等等均不清楚。因此探索KB/LPS复合物在体内的分布、代谢，对深入阐明KB的作用机制和安全性具有重要意义。
　　为解决上述问题，本课题拟以荧光素分别标记 LPS、KB以及研究中涉及的细胞和受体等，并应用激光共聚焦（LSCM）、流式细胞术(FCM)、siRNA干扰等技术探索KB/LPS复合物在体内的分布及代谢的分子机制。
　　方法：
　　1. KB/LPS复合物形成后对LPS在体内分布影响的研究。以FITC标记LPS（FITC-LPS）对KB/LPS复合物进行示踪,取FITC-LPS（1mg/kg）与KB（3.6mg/kg）体外混匀，37℃，振荡30min制备KB/FITC-LPS复合物，将LPS或KB/LPS复合物经尾静脉注射C57 BL/6小鼠体内，分别于注射后1、4、8和24 h采集外周血，分离血浆并检测FITC-LPS的荧光强度，明确KB对外周血LPS水平的影响；在相同时相点获取心、肝、脾、肺、肾等脏器并进行组织匀浆，检测匀浆液中FITC-LPS的荧光强度，明确游离LPS或KB/LPS复合物在小鼠各脏器的分布情况。
　　2.肝脏参与摄取KB/LPS复合物主要细胞类型的研究
　　2.1. C57 BL/6小鼠尾静脉注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS复合物1h后，获取小鼠肝脏制备组织冰冻切片；分别以Cy3-cytokeration18、Cy3-F4/80、Cy3-CD31、Cy3-GFAP抗体标记肝细胞（HC）、枯否细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LSEC）、肝星形细胞（HSC），利用LSCM检测肝脏主要细胞与FITC-LPS的共定位情况，确认肝脏参与LPS摄取和代谢的主要细胞类型。
　　2.2.尾静脉注射Clophosome.A.Clodronate liposomes制作KC耗损的小鼠模型，48 h后，获取肝组织制作冰冻切片，以Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration18抗体分别标记KC或HC，利用LSCM技术观察KC的耗损情况。KC耗损小鼠或C57BL/6小鼠经尾静脉注射 KB/FITC-LPS复合物，1h后获取肝组织制作冰冻切片，以 Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration18抗体分别标记KC或HC，LSCM检测肝组织冰冻切片中FITC-LPS的平均荧光强度以及与 KC和 HC的共定位情况，明确 KC是否参与介导肝脏对KB/FITC-LPS复合物的摄取。
　　2.3.采用肝原位灌洗，密度梯度离心并结合免疫磁珠分离，获取C57 BL/6小鼠原代HC和KC，以人肝肿瘤细胞（HepG2）或小鼠吞噬细胞（RAW264.7）作为对照细胞株；将上述细胞分别以 FITC-LPS或 KB/FITC-LPS复合物处理1h，FCM检测FITC-LPS的摄取，比较分析HC或KC摄取游离LPS和KB/LPS复合物的差异。
　　3. HC参与摄取KB/LPS复合物受体类型的研究
　　3.1.实时荧光定量PCR检测KB对HC中内吞相关受体mRNA表达的影响
　　获取C57 BL/6小鼠原代HC，用LPS(1μg/ml)或KB(15μM)或KB/LPS复合物处理HC4h，RT-PCR检测ASGPR、SR-B1、SR-A、TRFC、MARCO、LOX-1和TLR4的mRNA水平，分析HC中可能参与KB或 KB/LPS复合物摄取的受体类型。
　　3.2.采用蛋白质印迹(WB)、FCM等分析 ASGPR受体与 HC摄取KB/LPS复合物的关系
　　（1）获取C57 BL/6小鼠原代HC，KB(15μM)处理1、2、和4 h，WB检测HC的ASGPR受体的蛋白表达水平，并与同时相点未处理HC进行比较，分析KB对HC的ASGPR受体表达的影响。
　　（2）C57 BL/6小鼠尾静脉注射KB（3.6mg/kg），分别于1、2和4h取材，WB检测肝脏组织 ASGPR受体的蛋白表达水平，并与同时相点未处理小鼠进行比较，分析KB对小鼠肝组织的ASGPR受体表达的影响。
　　（3）利用siRNA转染下调HepG2的ASGPR受体表达，KB/FITC-LPS复合物处理ASGPR受体下调后的HepG2细胞1h，FCM检测HepG2摄取FITC-LPS的荧光强度，分析ASGPR受体表达下调对HC摄取KB/LPS复合物的影响，确认ASGPR受体是否参与HC对KB/LPS复合物的摄取。
　　3.3 LSCM检测KB与ASGPR受体的空间共定位情况，并结合竞争性摄取实验、分子模拟对接，以确认识别并结合KB是否是ASGPR受体介导KB/LPS复合物摄取的具体方式。
　　（1）获取 C57BL/6小鼠原代 HC，FITC-KB(15μM)处理 HC30min，Cy3-ASGPR标记ASGPR受体，LSCM检测，分析KB与ASGPR受体是否存在空间共定位。
　　（2）获取 C57BL/6小鼠原代HC，FITC-KB(15μM)单独或与 GaLNAc（0.25、0.5和1.0mM）共同处理细胞1h，LSCM检测，HC摄取FITC-KB的变化，确认GaLNAc与KB是否存在竞争被HC摄取的效应。
　　（3）利用分子对接软件AutoDockVina对KB与ASGPR受体H1亚基的结合位点及结合力进行模拟；利用AutoDockTools GUI在H1亚基的大小为20×18×20埃的空间，以6.46×-4.47×10.41点为中心，且包含碳水化化物识别区域为构象研究对象，分析比对KB与其可能结合位点及结合力，并通过软件AutoDockTools和LigPlot+，对计算结果进行分析。
　　4. HC降解和清除KB/LPS复合物的分子机制研究。获取TLR4-/-小鼠原代HC，分别以FITC-LPS或FITC-KB对KB/LPS复合物进行示踪，用KB/LPS复合物处理HC1h后，分别对HC内的早期内体（Cy3-EEA1抗体）或晚期内体（Cy3-Rab7抗体）或溶酶体（Cy3-LAMP1抗体）及ASGPR受体（Alexa Fluor647-ASGPR抗体）进行标记，LSCM检测分析KB/LPS复合物是否与ASGPR受体及内体或溶酶体存在空间共定位，确认KB/LPS复合物在HC内被降解和清除的可能途径。
　　结果：
　　1. KB/LPS复合物形成后对LPS在体内分布影响的研究。血浆检测结果显示，注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS复合物后1、4、8和24h， KB+LPS组较LPS组FITC-LPS检测值显著下降，结果表明KB/LPS复合物的形成加快了外周血LPS的清除；脏器组织匀浆检测结果显示，在1、4、8和24h， LPS主要分布在肝脏，而心、脾、肺、肾等较少，结果表明肝脏是参与 LPS代谢的主要器官；KB+LPS组较 LPS组肝组织内 FITC-LPS值显著增加；提示， KB/LPS复合物的形成促进了LPS在肝脏的富集。
　　2.肝脏参与摄取KB/LPS复合物主要细胞类型的研究
　　2.1. LSCM检测结果表明，肝组织切片中LPS主要分布于HC和KC细胞中，而HSC和LSEC未见明显的LPS摄取，提示，HC和KC是肝脏参与摄取LPS的主要细胞类型。
　　2.2.小鼠经尾静脉注射 Clophosome.A.Clodronate liposomes后，可见肝组织切片（Cy3-F4/80）阳性细胞(KC)数明显减少，而（Cy3-cytokeration18）阳性细胞(HC)数无明显变化，表明KC耗损；在KC耗损组和未外理组小鼠中， KB/FITC-LPS复合物均可被肝组织摄取，提示，KC耗损与否不影响肝脏摄取KB/LPS复合物，KC可能不是参与摄取KB/LPS复合物的主要细胞。
　　2.3. FCM检测结果表明，与LPS组进行比较，KB/LPS复合物形成可显著促进C57 BL/6小鼠HC、HepG2摄取LPS，同时也可显著抑制了C57 BL/6小鼠KC、RAW264.7摄取 LPS，提示，结合型 LPS主要依赖 HC摄取，游离型 LPS主要依赖KC摄取，KB/LPS复合物在肝脏主要被HC摄取。
　　3. HC参与摄取KB/LPS复合物受体类型的研究
　　3.1. RT-PCR检测结果表明，与未处理组比较，KB或 KB/LPS复合物均可显著上调HC的ASGPR受体的mRNA水平。
　　3.2. Western blot结果表明，未经KB处理的HC，在体外培养1、2和4h后，ASGPR受体的表达随时间的延长逐渐减弱；KB处理组HC在1和2 h ASGPR受体蛋白表达水平随时间延长逐步增加，而4 h则显著减少。KB注射小鼠肝组织，在1、2和4h，随时间的延长，ASGPR受体蛋白痕迹带颜色逐渐加深，而未处理组小鼠，呈逐渐减弱趋势，结果表明，KB被HC或肝脏摄取可显著上调ASGPR受体蛋白表达水平。FCM检测，相对荧光强度结果表明，HepG2的 ASGPR受体蛋白表达下调可显著抑制了HepG2摄取LPS（P<0.05，vs NC-siRNA处理组），提示，ASGPR受体参与了 HC摄取KB/LPS复合物。
　　3.3. LSCM检测图像显示，KB（绿色）与HC膜上的ASGPR受体（红色）在HC细胞膜上显示两者重合，结果表明KB与ASGPR受体存在空间共定位，提示，KB可与ASGPR受体结合。LSCM检测图像显示，随着GaLNAc加入量增加，HC内摄取的FITC-KB（绿色）荧光物质逐渐减少， FITC-KB的平均荧光强度结果表明，GaLNAc会显著抑制HC对KB的摄取，提示，GaLNAc与KB在HC膜上存在共同的介导内化途径。分子对接结果显示， KB与ASGPR受体的Asp241、Gln239、Glu252、Asn264、Asn208等氨基酸残基存在氢键结合，此外，KB还与ASGPR受体的Tyr272、Asp266、Arg270、Trp243、Asn264、Arg236、Thr258等残基存在疏水作用，提示， KB与ASGPR受体存在结合作用。
　　4. HC降解和清除KB/LPS复合物的降解清除途径研究。LSCM检测图像显示，KB/LPS复合物内化入HC后，均显示，FITC-KB（绿色）或FITC-LPS（绿色）在Cy3标记EEA1（红色）或Cy3标记Rab7（红色）或Cy3标记 LAMP1（红色）中存在，并与647-ASGPR（黄色）重合，表明，三者存在空间共定位现象；提示，KB/LPS复合物经ASGPR受体内化入HC后可能由ASGPR受体相关内体-溶酶体途径被降解和清除。
　　结论：
　　1. KB与LPS形成KB/LPS复合物后加快了小鼠外周血中LPS的清除，该现象与KB促进LPS在肝脏的富集密切相关。
　　2. KB/LPS复合物在肝脏主要被HC摄取，HC对KB/LPS复合物的摄取依赖膜受体ASGPR对KB的识别而介导其内化。
　　3. KB/LPS复合物经HC膜受体ASGPR介导内化后，可能由ASGPR受体相关的内体-溶酶体途径被降解、清除。

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第一章 前言

第二章 KB/LPS复合物形成对LPS在C57 BL/6小鼠体内分布的影响

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 肝脏参与摄取KB/LPS复合物的细胞和受体类型

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 HC降解和清除KB/LPS复合物的分子机制

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

参考文献

文献综述: 肝脏的免疫调理和免疫监控作用

博士就读期间发表论文情况

致谢