人端粒酶逆转录酶(hTERT)促胃癌侵袭转移的分子机制研究

摘要

目的：
　　细胞染色体末端含有一个TTAGGG的重复序列，这些末端DNA重复序列被命名为端粒，生理稳态时随着细胞分裂次数的增加，染色体端粒长度会逐渐缩短最终导致细胞的衰老。端粒酶是维持端粒延伸和长度稳定的关键酶，肿瘤细胞端粒酶持续高表达和活化而导致细胞具有无限增殖及永生化的特性。端粒酶是一种核糖核蛋白，包含有RNA及端粒酶逆转录酶，通过RNA模板合成特异性的TTAGGG重复序列以维持端粒的长度的稳定。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)作为端粒酶的催化亚单位，在端粒酶的活化中发挥决定性的作用，hTERT的表达即可代表端粒酶的活化。hTERT在90％以上的人类恶性肿瘤中高水平表达，可通过发挥其经典的逆转录酶活性促进肿瘤的无限增殖，而越来越多的研究表明，hTERT亦可通过非依赖逆转录酶活性而参与多种基因的表达调控。
　　我国作为胃癌的高发国家，胃癌发病率在男性和女性分别列第二和第三位，而致死率已跃居所有恶性肿瘤的第二位。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因，但目前针对胃癌侵袭转移的机制并不十分清楚。肿瘤侵袭转移是一个复杂的过程，主要包括细胞粘附能力改变、细胞外基质的降解、EMT及肿瘤血管生成等。肝素酶(Heparanase)作为唯一能降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的内切酶，可破坏细胞外基质屏障并促进锚定的多种细胞因子释放，从而参与多种肿瘤侵袭转移的调控。肝素酶在肿瘤组织及患者血清中高表达，与肿瘤的侵袭转移及新生血管密度密切相关，抑制肝素酶表达可明显抑制肿瘤侵袭转移，提示肝素酶是具有潜在价值的抗肿瘤靶标。
　　过去的研究主要关注于hTERT在肿瘤细胞无限增殖中的作用，随着研究的深入，hTERT在肿瘤侵袭转移中的作用及调控机制亦逐渐被揭示。课题组前期研究发现，过表达hTERT可明显增强细胞的体外侵袭能力，并且胃癌组织hTERT的表达与胃癌大小、淋巴结及远处转移密切相关，提示hTERT可能参与了胃癌侵袭转移的调控，然而具体的调控机制不清。本研究拟阐明hTERT调控胃癌细胞肝素酶表达进而促进胃癌侵袭转移的作用及分子机制，为以hTERT为靶点的胃癌诊断及治疗提供新的理论依据。
　　方法：
　　1.体外侵袭及体内转移实验，证实hTERT对胃癌细胞侵袭转移的调控作用;
　　2.采用双荧光素酶、qPCR及western blot检测hTERT对肝素酶启动子活性、mRNA及蛋白表达的影响，证实hTERT可调控肝素酶的转录表达;
　　3.生物信息学及qPCR实验筛选确定介导hTERT调控肝素酶表达的核转录因子;
　　4.双荧光素酶及western blot实验检测过表达或干扰c-Myc对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响，并利用ChIP实验检测c-Myc与肝素酶启动子结合情况，证实c-Myc可通过结合肝素酶启动子而调控肝素酶转录表达;
　　5.突变肝素酶启动子的c-Myc结合位点或干扰c-Myc表达，分别用双荧光素酶及western blot实验检测hTERT对肝素酶启动子活性和蛋白表达的影响，进一步证实c-Myc可介导hTERT对肝素酶的表达调控;
　　6.采用免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光共定位、ChIP及re-ChIP实验，证实hTERT可与c-Myc形成复合物并通过c-Myc结合于肝素酶启动子区;
　　7.分别干扰或过表达hTERT及c-Myc，通过双荧光素酶及western blot实验检测肝素酶启动子活性和蛋白表达，证实两者是肝素酶转录表达激活的必须调控分子;
　　8.采用TOP/FOP实验、免疫荧光及western blot实验证实hTERT可促进β-catenin核转位和转录活化，进一步通过Wnt/β-catenin信号通路促进c-Myc的表达上调，证实hTERT与c-Myc存在相互调控的反馈通路;
　　9.体外侵袭及体内动物实验检测干扰肝素酶表达对hTERT调控胃癌细胞生物学行为的影响，证实hTERT通过上调肝素酶表达促胃癌侵袭转移的作用;
　　10.免疫组化检测hTERT、c-Myc及肝素酶在胃癌及癌旁组织的表达情况，分析三者表达的相关性及与患者临床病理特征和预后的关系。
　　结果：
　　1.体外侵袭及体内动物实验发现，过表达或抑制胃癌细胞hTERT表达可促进或抑制胃癌细胞的侵袭转移;
　　2.双荧光素酶、qPCR及western blot实验发现，过表达或抑制hTERT表达可上调或抑制hTERT的启动子活性及转录表达，提示hTERT可调控肝素酶表达并与肝素酶的转录活性密切相关;
　　3.生物信息学预测、双荧光素酶及qPCR初步筛选发现，抑制核转录因子c-Myc表达可抑制hTERT诱导的肝素酶启动子活性和mRNA的表达上调，提示c-Myc可能参与了hTERT对肝素酶的转录表达调控;
　　4.ChIP实验证实c-Myc可直接与肝素酶启动子结合，而突变肝素酶启动子区的c-Myc结合位点，可明显抑制hTERT对肝素酶启动子活性的上调作用，提示hTERT通过c-Myc结合肝素酶启动子而调控肝素酶转录表达;
　　5.Co-IP及免疫荧光实验证实hTERT与c-Myc在胃癌细胞核中存在共定位和相互作用，ChIP及reChIP实验表明，hTERT与c-Myc形成的复合物可通过c-Myc与肝素酶启动子结合，并且过表达hTERT可促进复合物的形成及复合物与肝素酶启动子的结合，从而促进肝素酶的转录表达上调;
　　6.在过表达hTERT或c-Myc同时分别干扰c-Myc或hTERT的表达，可明显抑制过表达hTERT或c-Myc诱导的肝素酶启动子活性及蛋白表达，而同时过表达hTERT和c-Myc可促进更高的肝素酶启动子活性和蛋白表达水平，提示hTERT与c-Myc形成的完整复合物在肝素酶转录激活中发挥关键作用;
　　7.hTERT可促进β-catenin的转录活性和核转位，进一步研究发现，hTERT可通过Wnt/β-catenin信号通路促进下游基因c-Myc的表达上调。既往研究表明，c-Myc可直接结合于hTERT的启动子而促进hTERT的转录表达，提示hTERT与c-Myc间存在相互调控而形成正向反馈调控通路维持两者在胃癌细胞的高表达和肝素酶的持续表达上调;
　　8.干扰c-Myc或肝素酶表达可明显抑制hTERT促胃癌侵袭转移能力，提示hTERT可通过与c-Myc协同促胃癌细胞肝素酶表达上调进而促进胃癌的侵袭转移;
　　9.胃癌组织免疫组化实验发现，hTERT、c-Myc及肝素酶在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且三者在胃癌中的表达存在明显的正相关，生存分析发现，表达水平与胃癌患者的不良预后密切相关。
　　结论：
　　通过以上研究，我们证实了hTERT在胃癌侵袭转移中的重要调控作用，并发现hTERT可通过上调胃癌细胞肝素酶表达而促进胃癌的侵袭转移。进一步的机制研究发现，hTERT可作为辅助活化因子与核转录因子c-Myc结合形成转录复合物，该复合物可通过c-Myc直接与肝素酶启动子结合促进肝素酶的转录表达。在该调控机制中，hTERT可通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进c-Myc的表达上调，而c-Myc亦可作用于hTERT启动子调控hTERT的表达，从而形成一种正向反馈调控机制促进肝素酶的表达和胃癌的侵袭转移。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 人端粒酶逆转录酶(hTERT)可参与胃癌侵袭转移的调控

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 hTERT通过核转录因子c-Myc介导胃癌细胞肝素酶的表达上调

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 hTERT通过c-Myc促胃癌细胞肝素酶表达上调的分子机制

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 hTERT通过上调肝素酶的表达而促胃癌侵袭和转移

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 胃癌组织中hTERT、c-Myc和肝素酶的表达相关性及与预后的关系

6．1 实验材料

6．2 实验方法

6．3 实验方法

6．4 讨论

6．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 端粒酶逆转录酶(TERT)：抗肿瘤治疗的新靶点

攻读博士学位期间发表的论文及获奖情况

致谢