亚抑菌浓度头孢他啶抑制大肠埃希菌生物膜的作用及机制研究

摘要

目的：
　　本项目拟实验室标准菌E.coliMG1655为研究对象，首先确定亚-MIC CAZ对E.coli生物膜形成、细菌黏附性及运动能力的抑制作用;再通过同源重组的方法分别构建PBPs缺失株，考察敲除株生物膜形成能力、细菌黏附性及运动性的变化，明确E.coli中与生物膜形成相关的PBP。再在亚-MIC CAZ作用下，考察MG1655野生株及敲除株生物膜形成、黏附、运动能力、鞭毛及其合成相关基因的表达受到的抑制作用的差异，综合分析PBPs在其抑制MG1655生物膜形成过程中的作用，明确亚-MIC CAZ抑制E.coli生物膜形成的机制，为生物膜等临床耐药感染提供新的思路与参考靶点。
　　方法：
　　第一部分 亚-MIC头孢他啶对大肠埃希菌运动性、黏附性及生物膜形成能力的影响
　　1.1 药敏试验
　　采用倍比稀释法测定CAZ对E.coli MG1655的MIC。
　　1.2 亚-MIC CAZ对E.coli MG1655生物膜形成的剂量-效应分析采用结晶紫染色法，以MG1655为研究对象，每孔加入100μl菌液和100μl CAZ溶液。实验共分为6组，分别是空白组、CAZ1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC组，37℃培养24h后移除浮游菌和培养液，以PBS冲洗并晾干。1％结晶紫染色后用30％冰醋酸溶解着色的生物膜，通过酶标仪590nm处测定吸光度。
　　1.3 亚-MIC CAZ对E.coli MG1655生长的影响
　　将MG1655于37℃孵育24h，每2h测定OD590nm，绘制生长曲线。实验分为空白组、CAZ1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC组。
　　1.4 1/4MIC CAZ对E.coli MG1655黏附性的影响
　　实验分为空白组及1/4MIC CAZ组，37℃培养6h，生理盐水缓慢冲洗两次以除去未黏附细菌，每孔用1ml生理盐水充分吹打至黏附细菌完全脱落并溶解，采用菌落平板计数法测定肉眼可见菌落数。
　　第二部分 亚-MIC头孢他啶通过PBPs抑制大肠埃希菌生物膜形成的机制研究
　　2.1 E.coliMG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株的构建
　　CAZ主要通过三种PBPs与E.coli结合，分别是PBP1a（mrcA基因编码）、PBP1b（mrcB基因编码）以及PBP3（ftsI基因编码）。以质粒pKD3为模板通过PCR分别构建含有氯霉素(Chloramphenicol，Cam)抗性基因的打靶序列，并将其转化入MG1655/pKD46，Cam抗性平板筛选阳性克隆。利用pCP20质粒将Cam抗性基因删除，从而获得MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因缺失菌株。
　　2.2 基因敲除对E.coli MG1655细菌生长、生物膜形成、细菌黏附性及运动性的影响
　　2.2.1 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除对MG1655细菌生长的影响
　　采用分光光度法检测MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株细菌生长情况:将菌株分别于24孔板中37℃培养24h，每2h检测OD590nm并绘制生长曲线。
　　2.2.2 MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株生物膜形成能力的变化
　　将MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株分别于96孔板中37℃孵育24h，采用结晶紫染色法分别于590nm处测定吸光度。
　　2.2.3 MG1655 mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株细菌黏附性的变化
　　将MG1655野生株及mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株分别于96孔板中37℃孵育6h，采用菌落平板计数法测定四种菌株细菌黏附性的差异。
　　2.3 亚-MIC CAZ对E.coli MG1655野生株及敲除株生物膜形成能力、黏附性、运动性、鞭毛及其相关基因表达的影响
　　2.3.1 药敏实验
　　采用倍比稀释法测定CAZ对E.coli野生株及敲除株的MICs。
　　2.3.2 1/4MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株生长的影响
　　以E.coli MG1655野生株和mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株为研究对象，每种菌株分为对照组及1/4MIC CAZ组，于37℃培养24h，每间隔2h测定OD590nm，根据光密度绘制生长曲线。
　　2.3.3 1/4MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株生物膜形成能力的影响
　　分别将过夜培养的菌液稀释100倍并转入96孔板中，每孔200μ1，每种菌株实验分组均为空白组及1/4MIC CAZ组，每组设置3个复孔。
　　2.3.4 1/4MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株细菌黏附性的影响。
　　每种菌株实验分为空白组及1/4MIC CAZ组，采用菌落平板计数法测定亚-MICCAZ对四种菌株黏附性的影响。
　　2.3.5 1/4MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株运动性的影响
　　每种菌株均分为2组，分别为空白组及1/4MIC CAZ组，用牙签分别挑单菌落垂直沾至泳动运动培养基表面，37℃培养24h后，观察泳动运动情况并测量运动范围。
　　2.4 统计学分析
　　独立样本t检验用于两样本均数比较，统计以SPSS13.0进行。
　　结果：
　　第一部分 亚-MIC头孢他啶对大肠埃希菌运动性、黏附性及生物膜形成能力的影响
　　1.1 CAZ对E.coli MG1655的MIC为0.5μg/ml。
　　1.2 CAZ在1/8MIC～1/2MIC范围内呈剂量依赖性抑制E.coli MG1655生物膜的形成，其中1/2MIC CAZ对生物膜的抑制作用最强(P＜0.01)。
　　1.3 1/2MIC CAZ会抑制MG1655的生长，后续实验研究选取1/4MIC。
　　1.4 加入1/4MIC CAZ后，平板中的菌落数量较空白组显著减少(P＜0.01)，说明亚-MIC CAZ能够抑制E.coli细菌的黏附性。
　　1.5 在不含药物的培养基上长出的菌落平均直径显著高于加药组(P＜0.01)，结果说明亚-MIC CAZ能够抑制E.coli细菌的运动性。
　　第二部分 亚-MIC头孢他啶通过PBPs抑制大肠埃希菌生物膜形成的机制研究
　　2.1 经Cam抗性基因删除以后，mrcA、mrcB、ftsI基因敲除株的PCR扩增产物长度分别为486bp、611bp及555bp，从PCR产物长度判断，三种基因敲除株已成功分别构建。
　　2.2 基因敲除对E.coli细菌生长、生物膜形成、细菌黏附性及运动性的影响
　　2.2.1 MG1655野生株与基因敲除株细菌的生长曲线均没有显著差异，说明mrcA、mrcB、ftsI基因的缺失对MG1655的生长没有影响。
　　2.2.2 mrcA及ftsI基因敲除株生物膜形成能力与野生株没有显著性差异，而mrcB基因敲除株较野生株生物膜形成能力显著降低(P＜0.05)。
　　2.2.3 mrcA与ftsI基因敲除株细菌的黏附性与野生株没有显著差异，而mrcB基因敲除株细菌的黏附性较野生株显著降低(P＜0.05)。
　　2.2.4 仅MG1655 mrcB基因敲除株泳动运动范围直径显著低于MG1655野生株(P＜0.05)。
　　2.3 亚-MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株细菌生长、生物膜形成、黏附性、运动性及鞭毛的影响
　　2.3.1 测得的CAZ对E.coli MG1655野生株及mrcA基因敲除株的MIC均为0.5μg/ml，mrcB基因敲除株为0.125μg/ml，ftsI基因敲除株为1μg/ml。
　　2.3.2 1/4MIC CAZ对MG1655野生株及敲除株的生长均没有影响，因此选用1/4MIC进行后续研究。
　　2.3.3 1/4MIC CAZ仅对mrcB基因的E.coli生物膜形成没有显著的抑制作用。
　　2.3.4 亚-MIC CAZ对mrcB基因缺失株黏附性的抑制作用较其他菌株均减弱。
　　2.3.5 mrcB基因缺失株的运动性受到的抑制作用较其他菌株均减弱。
　　2.3.6 E.coli mrcB基因敲除株的细菌周围鞭毛较野生株显著减少，与亚-MIC CAZ作用下细菌的表现一致。
　　2.3.7 E.coli mrcB基因敲除株鞭毛合成结构基因的表达较野生株显著降低，与亚-MIC CAZ作用下细菌的表现一致。
　　结论：
　　1.亚-MIC头孢他啶能够抑制E.coli的运动性、黏附性及生物膜的形成。
　　2.基因敲除结果证明，PBP1b缺失的E.coli鞭毛生成相关基因表达降低导致鞭毛数量减少，运动能力降低，从而细菌的黏附能力及生物膜形成能力降低。
　　3.PBP1b是亚-MIC头孢他啶抑制E.coli生物膜形成的主要靶点。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 亚-MIC头孢他啶对大肠埃希菌运动性、黏附性及生物膜形成能力的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 亚-MIC头孢他啶通过PBPs抑制大肠埃希菌生物膜形成的机制研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 大肠埃希菌中青霉素结合蛋白PBP1b结构与功能的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢