超声联合微泡辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤体内微环境影响的实验研究

摘要

化疗是指在临床工作中对于肿瘤患者通过使用化学药物进入人体组织内从而达到消灭肿瘤细胞的作用，和肿瘤手术切除、肿瘤放射治疗同为目前临床工作中治疗肿瘤的三大主流方式。化疗的治疗效果主要取决于到达肿瘤靶向区域的化疗药物有效浓度和在这个肿瘤区域持续存在的时间。虽然是有效治疗肿瘤的主要方式之一，但化疗同时也不可避免的对全身其他系统产生较大的毒副作用。为了能取得良好的化疗效果，通常需要提高全身的化疗药物剂量才能够使足够的化疗药物达到肿瘤靶向区域。在前期本研究组已成功摸索制作了卡铂缓释微球（以下简称“CPMS”），并对多个肿瘤模型进行了探索性治疗，取得一定疗效，但未达到完全原位灭活肿瘤细胞目的。
　　目的：
　　本实验拟以兔VX2移植瘤为研究对象，采用超声引导瘤内注射卡铂缓释微球同时静脉注射微泡造影剂，并对肿瘤区进行超声辐照。利用超声辐照微泡爆破产生生物学效应以提高肿瘤细胞膜通透性，以期提高卡铂的生物利用率，达到最佳治疗效果、与降低毒副作用的目的。通过电镜对肿瘤细胞形态改变进行观察，同时探寻肿瘤微环境调控因子生长HIF-1α、ICAM-1改变情况，对超声辐照微泡产生的生物学效应介导下卡铂缓释微球瘤内注射治疗肿瘤内微环境改变影响及其作用机制进行探索。
　　方法：
　　1.卡铂缓释微球的制作及其靶向治疗模型的建立
　　在前期制备卡铂缓释微球的基础上，通过减小卡铂原药粒径、改变PLGA浓度、乳化时间、乳化温度方式，在保证载药率的基础上制作粒径更小的卡铂缓释微球，从而更适合注射到达靶向区域。
　　采用颗粒接种法、组织匀浆法分别对10只实验大白兔进行接种，以成瘤时间、肿瘤大小及成瘤数量作为考察指标，寻找适合本实验所需的建模方法。
　　2.诊断超声联合微泡辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤疗效的初步探讨
　　采用随机方式将组织匀浆法成瘤的40只VX2瘤兔分为4组：A组，仅正常对照;B组，S2000彩超仪4V1c探头联合脂氟显微泡辐照组;C组，单纯VX2肿瘤瘤内多点注射卡铂缓释微球;D组，VX2肿瘤瘤内多点注射卡铂缓释微球后，通过耳缘静脉注射脂氟显微泡造影剂，使用S2000彩超仪4V1c探头辐照肿瘤。实验结束后12h，各组随机取5只VX2瘤兔无菌手术获取完整肿瘤并行病理及肿瘤凋亡染色，对VX2肿瘤组织病理损伤情况及VX2肿瘤组织凋亡指数行定性及定量分析，研究不同实验方式对VX2肿瘤组织坏死凋亡的影响。其余VX2瘤兔于实验后第7天、第14天、第21天分别测量VX2肿瘤瘤体大小，以VX2肿瘤体积变化情况进行定量分析，观察不同实验方式肿瘤局部化疗疗效的改变。
　　3.不同强度超声联合微泡辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤体内微环境的影响
　　以组织匀浆法成瘤的24只VX2皮下移植瘤兔入组。随机分为4组，每组6只：Control组，VX2肿瘤作为对照组;CPMs组：对VX2肿瘤内多点注射卡铂缓释微球;S2000组：S2000彩色超声诊断仪联合微泡+卡铂缓释微球组;AP-170组：AP-170超声治疗仪联合微泡+卡铂缓释微球组。于实验后立即各组随机选取1只瘤兔对肿瘤组织进行取材固定，行透射电镜观察肿瘤细胞膜改变情况;各组剩余5只瘤兔实验后立即使用DH-2010A远红外热像仪观察肿瘤区域温度情况;实验6h后对各组肿瘤组织进行取材，以免疫组化(IHC)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫蛋白印迹(WB)检测肿瘤相关生长因子HIF-1α、ICAM-1表达情况;同时对各超声联合微泡辐照组体外卡铂缓释微球释药情况进行观察。
　　结果：
　　1.所制作卡铂缓释微球为白色粉末状球体，直径在5-100μm，包封率74.8％，载药率10.7％，微球表面光滑，球体完整，活动性好。关于建模，第15D颗粒接种法传代瘤体长径0.76cm±0.17cm(n=7)，组织匀浆传代法瘤体长径约1.08cm±0.23cm(n=10)。
　　2.实验D组肿瘤凋亡指数14.9±1.59％高于C组10.8±2.13％、B组5.16±0.42％、A组3.0±0.63％，与C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与A组、B组比较均有显著统计学差异(P＜0.01);HE染色显示D组可见片状坏死区域，肿瘤组织损伤程度最重。D组肿瘤大小在第7天525.22±57.89mm3，第14天930.87±102.34mm3，第21天1294.88±235.25mm3，增长程度较A、B、C组低，与C组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.(1)VX2肿瘤细胞透射电镜情况
　　Control组肿瘤细胞可见细胞结构完整，细胞膜光滑、连续性好;CPMs组细胞膜连续性尚可，细胞膜稍欠光整。S2000组、AP-170组肿瘤细胞高尔基体、线粒体呈水肿状，细胞膜不均匀改变，部分区域变薄、连续性差、可见小孔隙现象，以AP-170组更为明显。
　　(2)VX2肿瘤组织HIF-1α、ICAM-1情况
　　通过IHC、RT-PCR、WB等方式检测各组肿瘤组织中HIF-1α表达情况，结果显示呈逐渐降低趋势，ICAM-1呈增高改变。
　　(3)VX2肿瘤组织温度改变
　　Control组瘤兔肿瘤区域温度为37.04±0.55℃，CPMs组瘤兔肿瘤区域温度：37.38±0.46℃，S2000组瘤兔肿瘤区域温度在36.52±0.48℃，前三组瘤体温度值比较差异无统计学意义。AP-170组瘤兔肿瘤区域有升高，测值温度在40.24±0.64℃，与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　(4)体外药物释放情况
　　在37℃，CPMs组OD：0.1074±0.0027，S2000组OD：0.128±0.0044，AP-170组OD：0.1394±0.0024，CPMs组、S2000组、AP-170组溶液的吸光度呈现上升分布状态，但CPMs组与S2000组，S2000组与AP-170组两两比较其差异无统计学意义。在40℃，AP170组OD：0.1932±0.0069，与37℃其他组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.通过调整卡铂原药粒径、调整PLGA浓度、改变乳化温度等方式，在保持载药率的基础上，制作出粒径5～100μm，载药率约10～13％的卡铂缓释微球，使其更容易输送到达靶向器官或结构组织。颗粒接种法与组织匀浆法均可达到VX2肿瘤传代目的，组织匀浆法更适合短时间内大批量建模使用。
　　2.通过实验后肿瘤组织病理损伤坏死情况、肿瘤细胞凋亡情况以及7天、14天、21天对各组VX2瘤体体积观察，发现使用西门子S2000低频诊断超声联合“脂氟显”微泡造影剂辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤增殖有抑制效果，考虑其对化疗疗效有一定促进作用。
　　3.超声联合“脂氟显”微泡辐照VX2肿瘤组织，肿瘤细胞膜通透增大，细胞线粒体、高尔基体水肿，治疗级超声介导组AP-170组细胞改变情况较诊断级超声介导组S2000组明显，随着细胞通透性增大，微球释放出的化疗药物可以更多的进入肿瘤细胞，从而影响肿瘤细胞的增殖、代谢等活动。
　　4.超声联合“脂氟显”微泡辐照卡铂缓释微球VX2肿瘤组织，四组肿瘤组织内调控因子HIF-1α表达呈逐渐降低趋势，ICAM-1呈增高改变，随着超声强度的增加而改变。考虑肿瘤相关调控因子在肿瘤微环境中随受不同超声强度的UTMD影响而出现不同的表达。
　　5.使用AP-170治疗级超声联合“脂氟显”微泡辐照卡铂缓释微球VX2肿瘤组织，肿瘤组织内温度发生改变，可升高至40℃。随着肿瘤组织内微环境温度的提高肿瘤细胞蛋白可发生变性，影响细胞形态、功能，进而影响其增殖;受UTMD影响肿瘤细胞通透性增大，温度升高载药微球释放更多的化疗药物进入肿瘤细胞微环境影响其代谢，这可能是UTMD在本实验中影响肿瘤微环境的机制。
　　6.通过体外释药实验，强度更大的AP-170治疗级超声组释放化疗药物更多，通过辐照肿瘤组织内部温度升高，可促进卡铂缓释微球化疗药物释放，进一步影响肿瘤微环境的改变可能是改善化疗效果的机制。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 卡铂缓释微球的制作及其靶向治疗模型的建立

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 诊断超声联合微泡辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤疗效的初步探讨

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 不同强度超声联合微泡辐照卡铂缓释微球对VX2肿瘤体内微环境的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

本研究的局限性

参考文献

文献综述 超声介导下的靶向诊疗

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢