细菌超抗原SEB通过角质形成细胞外泌体诱导淋巴细胞增殖的研究

摘要

目的：
　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的皮肤定植菌，它不仅可以引起多种感染性疾病，也与银屑病、湿疹、特应性皮炎等多种炎症性皮肤病关系密切。细菌超抗原引起的免疫反应是金黄色葡萄球菌致病的重要机制。角质形成细胞是表皮的主要组成细胞（约90％以上），也是细菌超抗原接触的主要细胞。已有研究表明角质形成细胞可以作为抗原提呈细胞，提呈细菌超抗原，诱导淋巴细胞增殖。然而，既往实验均使用角质形成细胞与淋巴细胞混合培养的方式来探究角质形成细胞提呈超抗原的能力，角质形成细胞是否可以通过非直接接触的方式，提呈超抗原到T细胞仍不清楚。
　　目前一种纳米级囊泡-外泌体逐渐成为细胞间交流的研究热点。外泌体是细胞向细胞外基质中分泌的直径约30-100nm的囊泡样小体，国内外各项研究已证实外泌体可以作为载体，携带抗原或者MHC多肽复合物到T淋巴细胞介导免疫反应。因此在本研究中提出假设，角质形成细胞外泌体可能作为载体，介导角质形成细胞与淋巴细胞之间信息交流，使得角质形成细胞以非接触方式提呈细菌超抗原到淋巴细胞成为可能。本研究以人角质形成细胞株（HaCaT细胞株）为研究对象，探讨HaCaT细胞是否可以在非接触的条件下辅助SEB诱导淋巴细胞增殖，并初步探究角质形成细胞是否可以通过外泌体来参与超抗原介导的免疫反应。
　　方法：
　　本研究分两部分，主要研究内容如下：
　　第一部分：通过Transwell小室构建了HaCaT细胞与CD3+T细胞在非接触的条件下的混合培养。通过CCK8实验以及CFSE示踪法分别检测HaCaT细胞在非接触的情况下诱导T淋巴细胞增殖情况。
　　第二部分：
　　1.多步离心法提取HaCaT细胞外泌体，电镜检测所提取的外泌体大小及形态，Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、Tsg101及阴性蛋白Calnexin;
　　2.激光共聚焦显微镜检测HaCaT细胞外泌体是否可以作用于T淋巴细胞;
　　3.Western blot检测HaCaT细胞外泌体上MHCⅠ、MHCⅡ、ICAM分子，探究其是否有抗原提呈的分子基础;
　　4.CFSE示踪法检测负载SEB的HaCaT细胞分泌的外泌体是否可以诱导T淋巴细胞增殖;
　　结果：
　　第一部分：
　　CCK8实验以及CFSE示踪法均证实负载SEB的HaCaT细胞可以在非接触的条件下诱导T淋巴细胞增殖;
　　第二部分：
　　1.多步离心法提取的HaCaT外泌体符合外泌体的基本特性，并且纯度较高;
　　2.激光共聚焦显微镜观察到荧光标记的HaCaT外泌体可以作用于T淋巴细胞;
　　3.HaCaT外泌体上可以检测到MHCⅠ分子，IFN-γ处理后HaCaT外泌体上MHCⅠ分子表达升高，且可以表达MHCⅡ分子;
　　4.在IFN-γ处理后，负载SEB的HaCaT细胞分泌的外泌体可以同时诱导CD4+T、CD8+T淋巴细胞的增殖。
　　结论：
　　许多炎症性皮肤病的发病及加重均与金黄色葡萄球菌定植关系密切，细菌超抗原引起的免疫反应是金黄色葡萄球菌致病的重要机制。实验证实在SEB相关的皮肤免疫中角质形成细胞以及T细胞之间存在一种非接触的作用方式，并且实验结果提示外泌体是角质形成细胞参与细菌超抗原相关皮肤疾病的另一途径。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 角质形成细胞在非直接接触条件下辅助细菌超抗原诱导T淋巴细胞增殖

2．1 材料和方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 细菌超抗原SEB通过角质形成细胞外泌体诱导T淋巴细胞增殖

3．1 材料和方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 角质形成细胞相关外泌体研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢