中性粒细胞胞外捕网促足细胞自噬的机制及盐酸青藤碱的干预效应

摘要

目的：
　　足细胞(podocyte)是一种终末分化的脏层上皮细胞，通过交错形成的足突与内皮细胞、基底膜共同构成肾小球滤过屏障。当足细胞暴露于多种损伤因素，可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平升高，从而导致胞内蛋白及DNA损伤。足细胞在维持肾脏有效滤过屏障中发挥至关重要的作用，是多种肾小球疾病损伤的中心环节。
　　足细胞在肾脏炎症反应中能够招募循环中的中性粒细胞至炎症区域发挥免疫监视和炎症保护作用。在炎症过程中，中性粒细胞本身能够分泌多种细胞因子、趋化因子及调节分子，从而激活更多中性粒细胞活化并募集循环中其它免疫细胞。中性粒细胞胞外捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是新近发现的一种中性粒细胞活化并释放大量溶菌酶及染色质纤维等自身组分，从而产生杀菌及免疫效应的新形式。NETs过度形成或清除障碍导致大量自身组分暴露于免疫监视，并作为内源性危险信号打破自身免疫耐受，成为多种肾脏疾病的研究热点。
　　自噬是一种维持细胞自身内环境稳定的保护性机制，通过处理并回收胞内损伤蛋白或细胞器，以应对细胞所处的各种不利因素。然而，过度自噬将导致细胞死亡。足细胞本身表现出较高的基础自噬水平。近来发现ROS是细胞受到各种刺激因素发挥作用的“交汇点”，作为主要的细胞内信号传感器维持自噬，启动自噬小体形成并调节自噬过程，是自噬调节的上游分子。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)是细胞ROS产生的两大主要来源之一。NOX是位于细胞膜上的复合酶，由多种催化亚基和调节亚基组成，其中p47-phox是主要调节亚基，能够定位在细胞膜并整合其它亚基，在NOX全酶激活中起到重要作用。肾素-血管紧张素系统在肾脏的病理生理发展过程中发挥重要作用，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是其主要的效应分子，足细胞上既表达AngⅡ受体，也能分泌AngⅡ。盐酸青藤碱(SN)是一种具有抗炎、免疫调节的生物碱，新近发现SN能够通过降低神经小胶质细胞ROS水平发挥神经保护作用。
　　基于上述研究，我们通过观察NETs对足细胞AngⅡ分泌的影响及AngⅡ对足细胞自噬的影响，探讨SN通过抑制ROS途径干预AngⅡ诱导的足细胞自噬的可能机制，进一步明确NETs在肾脏炎症中对足细胞的损伤机制及SN可能的肾脏保护作用。
　　方法：
　　1.采用小鼠琼脂糖明胶皮下埋植法获取大量具有自发NETs倾向的中性粒细胞。人条件永生化足细胞(AB8/13)和鼠足细胞培养。
　　2.采用免疫荧光观察中性粒细胞形态和NETs形成情况，以及p47-phox亚基在细胞膜表达情况。
　　3.流式细胞术鉴定所分离中性粒细胞纯度及测定足细胞ROS水平。
　　4.ELISA检测NETs与足细胞共培养后上清的AngⅡ浓度
　　5.采用Western blot检测足细胞LC3B总蛋白、p47-phox膜蛋白表达水平。
　　6.透射电镜观察足细胞自噬体形成。
　　结果：
　　1.皮下埋植琼脂糖明胶能够获取大量高纯度（达95.7％）、具有自发NETs倾向的中性粒细胞。
　　2.NETs能够增加足细胞AngⅡ分泌(p=0.027)。
　　3.SN能够减少中性粒细胞NETs形成(p=0.002)。
　　4.SN本身不会增加足细胞LC3B蛋白比例，不影响自噬水平(p＞0.05)。
　　5.AngⅡ刺激后足细胞LC3B蛋白比例明显增加（*P＜0.05），透射电镜下观察自噬小体数量明显增加（P＜0.001）。SN干预后LC3B蛋白比例和自噬小体数量均降低（分别为P＜0.05和P＜0.001）
　　6.AngⅡ能够显著增加足细胞ROS生成(P＜0.01)。经不同浓度的SN(10-8～10-4 M)干预后ROS水平较AngⅡ刺激组显著下降（P＜0.05、P＜0.01）。
　　7.AngⅡ能显著增加足细胞p47-phox在细胞膜上表达，不同浓度的SN(10-8～10-4M)预处理后能抑制其表达(P＜0.001)。
　　结论：
　　1.皮下埋植琼脂糖明胶法可获取大量高纯度、具有自发NETs倾向的中性粒细胞;
　　2.NETs能够刺激足细胞分泌AngⅡ。
　　3.AngⅡ可通过增加ROS产生促进足细胞自噬，SN具有干预效应;其机制可能与抑制细胞膜上的p47-phox亚基表达，从而降低ROS水平减少自噬相关。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 中性粒细胞胞外捕网对足细胞分泌血管紧张素Ⅱ的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 小结

2．5 讨论

第三章 血管紧张素Ⅱ诱导足细胞自噬及盐酸青藤碱的干预效应

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 小结

3．5 讨论

第四章 血管紧张素Ⅱ诱导足细胞自噬的机制及盐酸青藤碱的调节

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 小结

4．5 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎动物模型的研究进展

攻读硕士期间发表文章

致谢