Atgl基因敲除对C57BL/6小鼠肾脏结构和功能的影响及机制研究

摘要

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)已成为导致终末期肾病的首要原因，糖尿病肾病的防治已成为亟待解决的全球性健康问题。尽管如此，临床上对糖尿病肾病实际干预治疗的手段和疗效非常有限，从某种程度上讲，是由于其发病的病理学机制仍不清楚。而越来越多的临床和基础研究提示脂质代谢与其关系密切。
　　越来越多的研究提示脂代谢紊乱可能通过多种途径参与了糖尿病肾病的发病过程。血浆中过量的甘油三酯和其代谢产物游离脂肪酸可通过炎症或直接粘附的方式影响血管内皮细胞功能;过量的细胞外游离脂肪酸又可以转运进脂肪细胞或非脂肪细胞并以甘油三酯的形式储存在胞浆脂滴中。脂肪细胞具有独特的储存甘油三酯的能力。然而，对于非脂肪细胞如足细胞来讲，储存甘油三酯的能力十分有限。尽管甘油三酯被认为是最中性无害的细胞内脂质存贮形式，甘油三酯的堆积一方面可以对细胞形成物理压迫;另一方面，其中间代谢产物如甘油二酯、神经酰胺等可以对细胞产生损伤，这种效应被称为脂毒性作用。在肾脏中，可以导致肾小管间质性炎症、纤维化甚至是肾衰。
　　脂肪甘油三酯脂肪酶是脂质分解过程中的重要组分，它是甘油三酯分解代谢中第一步反应的限速酶。Haemmerle, et al.等首次在Atgl基因敲除(Atgl-/-)小鼠包括心肌、肝脏和肾脏等内脏器官中发现存在大量甘油三酯聚集。自此之后，越来越多的研究证实Atgl在维持心脏和肝脏正常结构和功能中发挥了重要作用。然而关于Atgl与肾脏之间的关系还并不清楚。我们在预实验中发现Atgl-/-小、鼠尿白蛋白增加，这提示其肾小球滤过屏障可能受损。
　　目的：
　　通过观察Atgl-/-小鼠肾脏结构和功能的变化明确Atgl基因缺失对肾脏的影响，并通过构建ATGL低表达足细胞模型，研究Atgl影响肾脏功能的可能机制。
　　方法：
　　1.检测Atgl-/-小鼠血清TG，FFA，TC浓度以及心脏、肝脏、肾脏组织中甘油三酯的含量。
　　2.检测Atgl-/-小鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)和血浆肌酐(sCr)浓度以了解Atgl敲除对肾功能的影响;通过功能磁共振(fMRI)观察Atgl敲除前后肾小球滤过屏障的变化。HE染色观察肾脏结构改变，油红O染色观察脂滴在肾脏中的分布情况。透射电镜观察肾脏的超微结构改变。
　　3.利用Atgl-shRNA慢病毒转染条件永生化足细胞的方法构建ATGL低表达的足细胞模型。F-actin染色观察细胞内微丝排列变化，annexin V-Cy3染色和TUNEL染色观察细胞死亡数量及主要死亡方式。
　　4.利用活性氧(ROS)清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理足细胞，观察ROS清除前后细胞微丝分布及细胞凋亡数量改变。
　　结果：
　　1.从第8周开始，Atgl-/-小鼠体重较Atgl+/+小鼠明显增加，并随着时间的增长，增加的幅度越来越大。Atgl-/-小鼠血清FFA、TG、TC浓度均较Atgl+/+小鼠明显降低;心脏、肝脏、肾脏中TG含量较Atgl+/+小鼠相比均有显著升高，提示Atgl-/-小鼠存在明显的脂质异位沉积。
　　2.Atgl-/-小鼠尿ACR明显升高，HE染色提示肾小球肾小管中均有明显脂滴堆积，肾小囊腔明显缩小;fMRI进一步提示肾小球滤过屏障受损。油红O染色显示脂滴弥漫性分布于肾小球和肾小管中，其中以肾小管为主。电镜下观察到足细胞和肾小管细胞中有大量脂滴存在;肾小球足细胞足突融合消失;肾小管微绒毛萎缩脱落，足细胞及肾小管细胞内线粒体肿胀，内脊消失。
　　3.ATGL低表达的足细胞内ROS含量显著升高，F-actin染色提示纤维肌动蛋白增粗并由细胞中央向细胞周边分布，annexin V-Cy3染色和TUNEL染色提示细胞凋亡明显增加，这种效应可以被活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸部分缓解。
　　结论：
　　综上所述，我们的结果说明Atgl基因在维持正常的脂代谢、肾脏结构和功能中发挥重要作用。Atgl基因敲除导致小鼠肾脏中甘油三酯大量沉积并导致肾小球滤过屏障受损，尿白蛋白增加，这可能主要是通过改变足细胞微丝排列和线粒体结构，导致足细胞足突融合和细胞凋亡实现的。ROS清除剂可以有效减少ATGL低表达对足细胞微丝重排和凋亡的影响。

目录

声明

略缩语表

摘要

第一章 前言

第二章 Atgl基因敲除对C57BL／6小鼠肾脏结构和功能的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 ATGL表达下调对足细胞影响的研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 结论

3．4 小结

第四章 ATGL表达下调对足细胞影响的机制探讨

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 脂肪甘油三酯脂肪酶介导的脂解作用从多方面调节线粒体功能

攻读学位期间的研究成果

致谢