血清中长链非编码RNA检测方法的建立及其在结直肠癌诊断中的应用

摘要

结直肠癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人们的身心健康。虽然早期结直肠癌患者治愈率高，5年生存率可达90％，但由于目前缺乏有效的早期诊断方法，大多数结直肠癌患者确诊时已为中晚期，其生存率仅为10％～15％。结直肠癌的发生是一个复杂而缓慢的过程，多数认为由腺瘤或者锯齿状息肉到早期癌再到进展期癌。其演变过程涉及复杂的基因和蛋白表达变化。糖链抗原(carbohydrate antigen CA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等一些表达变化的分子能有效的筛查中晚期结肠癌，但对于早期结直肠癌的诊断率较低。因此，筛查并验证结直肠癌相关基因及蛋白的表达谱有利于提高早期结直肠癌的诊断率，从而提高患者治愈率并延长生存时间。
　　长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度为200～100，000 nt且不编码蛋白的单链RNA分子。近年来，大量研究表明肿瘤的复发、转移及患者的预后均与lncRNAs的表达失调密切相关，其表达谱可能作为诊断恶性肿瘤的一类新的生物标志物，如HOTAIR、ncRuPAR等。文献报道，在结直肠癌组织中多条lncRNAs表达上调，且与患者不良预后密切相关，如CCAT1、HOTAIR、H19等。最新的研究表明血清中lncRNAs可作为一种有效的非侵袭性的生物标志物诊断肿瘤，但在结直肠癌患者血清中lncRNAs的表达谱及其检测方法极少研究。因此，本研究拟以lncRNAHOTAIR为例，建立血清中lncRNA的检测方法，进一步采用lncRNA芯片筛选结直肠癌组织中表达差异显著的lncRNAs，并采用qRT-PCR验证候选lncRNAs在结直肠癌组织及患者血清中的表达，采用工作特征曲线(ROC)分析lncRNAs的表达谱在结直肠癌诊断中的应用价值。
　　目的:建立血清中lncRNA的检测方法，评价表达差异的lncRNA在结直肠癌诊断中的应用。
　　方法:1.采用lncRNA芯片筛选结肠直癌组织中表达差异的lncRNAs。
　　采用lncRNA芯片技术筛查3对结直肠癌及癌旁组织中表达差异的lncRNAs，按照一定的筛选原则，候选7条lncRNAs，以及文献报道在结直肠癌组织中高表达的3条lncRNAs，共计10条lncRNAs作为研究对象。
　　2.采用qRT-PCR验证表达差异的lncRNAs。
　　2.1采用TRIzol及TRIzol LS法共提取25对结直肠癌及癌旁组织样本与67例结肠癌患者、50例正常志愿者血清样本中的总RNAs。
　　2.2采用qRT-PCR相对定量法检测已报道在结直肠癌中高表达的HOTAIR及候选的9条lncRNA的表达情况:采用PrimeScript结RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂（大连TaKaRa公司）对总RNA进行逆转录。采用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂（大连TaKaRa公司）对合成的cDNA进行扩增。组织中以β-actin为内参，血清中引入线虫的microRNA(Cel-miR-39)作为内参。
　　2.3.ROC分析lncRNAs表达谱在结直肠癌诊断中的准确率。
　　2.4采用Pearson做lncRNAs表达谱与结直肠癌TNM分期、淋巴结转移及CA19-9值的相关性分析。
　　结果:1.成功建立血清中lncRNAs(LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3、H19及HOTAIR)的检测方法。
　　2.HOTAIR在结直肠癌组织及患者血清中高表达，且与患者淋巴结转移相关。10例配对结直肠癌及癌旁组织样本中，HOTAIR在8例癌组织中的表达高于配对癌旁组织，两者间差异有统计学意义;在47例结直肠癌患者及40例正常志愿者血清样本中，结直肠癌患者血清中HOTAIR的表达高于正常志愿者，两者间差异有统计学意义。TNMⅢ/Ⅳ期的结直肠癌患者血清中HOTAIR的表达高于正常志愿者，Ⅲ/Ⅳ期高于Ⅰ/Ⅱ期;淋巴结转移及非转移的结直肠癌患者血清中HOTAIR的表达均高于正常志愿者，且淋巴结转移患者高于非转移患者;ROC分析提示HOTAIR可能作为结直肠癌诊断的有效标志物。
　　3.在结直肠癌组织中筛选表达差异显著的lncRNAs。由lncRNA基因芯片筛选出P＜0.01，lncRNA长度小于1000bp，高表达倍数＞5，且排前7位的lncRNAs，即:LINC01608、XIST、LINC00594、RP11-91J3.3、SEMA3B-AS1、RP11-396O20.2和RP11-867G23.13,加之文献已报道在结直肠癌组织中高表达的2条lncRNAs: CCAT1和H19共计9条lncRNAs。
　　4.LINC00594和RP11-91J3.3在结直肠癌患者血清中显著高表达。在25例配对结直肠癌及癌旁组织样本中，LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3和H19的表达在两者间差异无统计学意义;在67例结直肠癌患者及50例正常志愿者血清样本中，LINC00594和RP11-91J3.3在结直肠癌患者血清中的表达高于正常志愿者，两者间差异有统计学意义，ROC分析提示其可能作为结直肠癌诊断的有效标志物;两组中LINC01608和H19的表达无统计学差异。
　　5.结直肠癌患者血清中LINC00594和RP11-91J3.3的表达与TNM分期，淋巴结转移及CA19-9值无显著相关性。
　　结论:1.建立了血清中lncRNAs的检查方法。
　　2.血清中LINC00594、RP1191J3.3和HOTAIR可能作为作为诊断结直肠癌的新的生物标志物。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 血清中长链非编码RNA HOTAIR检测方法的建立及其在结直肠癌诊断中的应用

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 探索血清中的多条长链非编码RNA检测方法及其在结直肠癌诊断中的应用

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 长链非编码RNA在结直肠癌中的作用

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢