卵巢癌干细胞样细胞通过自分泌CCL5促进内皮细胞分化和肿瘤血管形成

摘要

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)以其自我更新和高度致瘤能力而著称。另外，近年来CSCs所具备的多向分化潜能也成为一个研究热点，得到了学界的热切关注。近期有研究表明，在恶性胶质瘤和乳腺癌中，CSCs能够分化为有功能的血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)并参与肿瘤的血管形成。已经有大量科学文献证实丰富的血管形成是癌症的一大特征，其能够为肿瘤的进展提供能量来源，为肿瘤细胞的侵袭和转移提供有利的渠道，也是肿瘤组织不可或缺的生存支柱。因此，探讨以往未曾研究透彻的、潜在的干细胞源性的血管生成机制有利于完善肿瘤的发生、发展理论。我们的前期研究成果已经证明了卵巢癌干细胞样细胞(cancer stem-like cells，CSLCs)能够合成和分泌大量的趋化因子CCL5，并在细胞表面高表达CCL5的特异性活化受体。已有文献报道，CCL5作为一个重要的促恶性因素，其与肿瘤的生长、转移和进展都密切相关，尤其，CCL5对肿瘤的血管生成具有重要的意义。
　　研究目的:血管生成对卵巢癌进展、侵袭、转移过程有非常重要的作用。然而，传统的抗血管生成治疗对肿瘤的控制却作用有限，且伴随着一系列毒副作用。在本研究中，我们发现了卵巢癌CSLCs能够分化成为具备内皮细胞形态和功能的内皮细胞，并探讨了趋化因子CCL5在这个内皮分化过程中的作用及机制。我们期望这些结果能够帮助完善肿瘤的血管生成理论，并为临床卵巢癌治疗提供一个新的抗血管生成策略。
　　研究方法:1.在前期对卵巢癌CSLCs研究的基础上，通过体外基质胶血管形成实验和免疫标记技术明确卵巢癌CSLCs是否具有内皮分化和血管形成能力。根据对裸鼠体内移植瘤组织进行血管内皮细胞标志物的免疫荧光检测，明确移植瘤组织的内皮细胞来源，从而再次求证卵巢癌CSLCs是否具有内皮分化和血管形成能力。
　　2.通过单克隆抗体阻断CCL5功能、病毒转染下调CCL5表达、加入重组人CCL5因子、阻断CCL5特异性受体等体外实验证明CCL5有调节卵巢癌CSLCs分化为ECs的能力。再利用裸鼠移植瘤模型体内实验，证明CCL5对于促进干细胞来源的血管生成有重要作用。
　　3.利用Western blot、免疫荧光检测卵巢癌CSLCs中CCL5可能激活的通路。再通过化合物阻断等方式明确CCL5是通过活化何种信号通路调节来卵巢癌CSLCs向ECs分化的过程，最后提出CCL5调节CSLCs向ECs分化过程中的可能存在的机制。
　　研究结果:1.体外基质胶血管形成模型证实了卵巢癌CSLCs能够形成微管网络，其形态与人脐静脉内皮细胞所形成的微血管网类似，但卵巢癌非干细胞在同样条件下却没有形成类似的微管网络。免疫荧光标记技术显示CSLCs分化所形成的微管网络细胞表达血管ECs特异性标记物CD31、VE-cadherin和vWF。在裸鼠移植瘤实验中， CSLCs移植瘤内可见较丰富的血管，而非干细胞移植瘤血管较少。免疫荧光检测发现CSLCs移植瘤内既有人源性的CD31表达也有鼠源性的CD31表达，而非干细胞移植瘤内只有鼠源性的CD31表达，无人源性CD31表达。
　　2.首先，单克隆抗体阻断CCL5功能实验显示阻断CSLCs内的CCL5功能后其形成微管网络的能力下降，且这种下降具有浓度依耐性。第二，病毒转染CSLCs下调CCL5表达，CSLCs所形成的微管网，其管腔数和分支长度都明显少于对照组。第三，CSLCs与重组人CCL5因子共培养，所形成小管网络的管腔数和分支长度比对照组增加。第四，分别阻断CCL5的特异性活化受体CCR1、CCR3、CCR5之后，CSLCs所形成的的微管网内的微管管腔数和分支长度均较对照组减少。裸鼠移植瘤实验和免疫组织化学检测显示下调CSLCs的CCL5表达后，CCL5下调组与对照组的肿瘤大小无明显差异，且两组移植瘤组织内鼠源性CD31阳性细胞的数量无明显差异。但就人源性CD31阳性细胞数而言，CCL5表达下调组移植瘤内的人源性CD31阳性细胞数明显少于对照组。
　　3.Western blot和免疫荧光检测结果显示病毒转染沉默CSLCs的CCL5基因，导致胞核内的p65和STAT3表达减少，而胞浆内的p65和STAT3表达较对照组增加，且整个细胞内的磷酸化p65和磷酸化STAT3水平明显低于对照组。化学阻断NF-κB或STAT3信号通路导致CSLCs的血管形成和维持能力受抑制。
　　研究结论:1.卵巢癌CSLCs能够分化成为血管内皮细胞。
　　2.卵巢癌CSLCs通过自分泌趋化因子CCL5促进自身分化成为血管内皮细胞并参与肿瘤组织内的血管形成。
　　3.CCL5通过活化NF-κB和/或STAT3信号通路调控卵巢癌CSLCs向血管内皮细胞分化。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 卵巢癌干细胞样细胞能够分化成为血管内皮细胞并参与肿瘤的血管形成

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 CCL5调节卵巢癌干细胞样细胞分化为内皮细胞

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 CCL5通过与CCR1、CCR3、CCR5结合调节卵巢癌干细胞样细胞分化为内皮细胞

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

第五章 CCL5能够活化卵巢癌干细胞样细胞内NF-κB、STAT3信号通路

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

第六章 CCL5通过活化NF-κB和／或STAT3信号通路调控卵巢癌干细胞样细胞向血管内皮细胞分化

6．1 材料与方法

6．2 结果

6．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 CCL5与肿瘤

科研成果

致谢