Ghrelin对放烧复合伤创面的促愈效应及机制研究

摘要

放烧复合伤(combined radiation-burn injury, CRBI)是指以放射损伤为主，同时或相继发生烧伤的一类放射复合伤。放烧复合伤属于军事特种医学的研究范畴，通常仅见于战现场或核事故，而罕见于日常生活。放射性损伤是其具有较大伤害性的首要原因，而烧伤的存在增加了病情的复杂性，常表现为“加重效应”。对于中度及以上的放烧复合伤，以“早期急性应激和休克、全身急性炎性反应、造血功能障碍、免疫抑制、胃肠道功能损伤及烧伤创面的延迟愈合及不愈合”为主的多种病理表现使治疗变得较为棘手。内外源性感染是引起死亡的主要原因，而烧伤创面的延迟愈合或不愈合则是不断加重的外源性感染的主要来源。因此，促进放烧复合伤创面愈合有助于延缓病情发展，并提高存活率和改善预后。
　　目前对放烧复合伤的研究均限于动物水平，其中针对创面愈合的研究较少且缺乏系统性。这些物理（如创面护理、切痂等），化学（如碘伏和苯妥因等）或生物（如间充质干细胞等）治疗方法虽然在一定程度上改变了创面的愈合状态，但对动物整体伤情的减轻似乎并无突出贡献;某些方法不仅“性价比”低，还容易产生副作用，具有一定的应用局限性。Ghrelin是一种内源性多功能“脑-肠肽”，前期研究显示ghrelin可通过减弱急性应激反应，减轻急性炎性反应，促进造血功能恢复，降低放烧复合伤大鼠死亡率，可应用于放烧复合伤的综合治疗。Ghrelin具有合成容易、廉价易得、给药方便等优点，其对放烧复合伤动物的救治作用，除上述机制外，推测还可能与促进烧伤创面愈合有关。因此，本课题从以下几个层次研究了ghrelin促进放烧复合伤创面愈合的效应并探讨了其可能机制:
　　第一部分，ghrelin对放烧复合伤创面的促愈效应观察，研究ghrelin促进创面愈合的整体效应。
　　第二部分，ghrelin促进放烧复合伤大鼠创面肉芽组织形成和成熟的研究。
　　第三部分，ghrelin促进放烧复合伤大鼠创面愈合的炎症机制研究。
　　第四部分，ghrelin与TNF-α对放烧复合伤大鼠创面成纤维细胞相关生物学功能的影响及可能分子机制。
　　以上4个部分的研究内容均涵盖了ghrelin在“动物—组织—细胞—分子”各个层面上对放烧复合伤大鼠创面愈合的贡献作用，主要表现为与创面愈合相关的炎症机制研究。获得的主要研究结果如下:
　　1.放烧复合伤导致大鼠血清ghrelin浓度显著下降，伤后第7d最为明显(下降约50％)，之后逐步恢复至正常水平。50，100和200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗组大鼠在伤后24d的平均创面愈合率分别约为60％，50％和30％（与单纯复合伤组比较，P＜0.05）;同时也缩短了创面闭合所需平均时间约3～8d（与单纯复合伤组比较，P＜0.05）。体重影响方面，200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗还可促进复合伤大鼠体重增加，最高可达5％(约11g)。造血方面，在伤后3，7，14d，200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗显著抑制了WBC和PLT数目的减少（与单纯复合伤组比较，P＜0.05）。
　　2.各实验组大鼠创面肉芽组织内DNA、胶原（羟脯氨酸）、氨基己糖和总NO含量，随着创面的逐渐修复，均呈现出先增加后减少的变化趋势;在检测时间点内，伤后第20d为含量变化最高点。与单纯烧伤组比较，复合伤组肉芽组织内DNA、胶原、氨基己糖和总NO含量均有显著降低(P＜0.05)，而200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗组在相应时间点均显著促进了以上各项指标的提升（与复合伤组比较，P＜0.05）:DNA含量在复合伤后10，20和30天分别下降约67％，56％和63％，ghrelin分别提高了其含量约138％，98％和136％;胶原含量在伤后第10，20d分别下降约36％和32％，ghrelin均提高了其含量约36％;氨基己糖含量在伤后第10，20d分别下降约34％和36％，ghrelin提高其含量约26％和46％;总NO含量在第10，20d分别下降约77％和50％，ghrelin提高其含量约200％和33％。胶原天狼猩红和Masson染色也显示复合伤肉芽组织内胶原含量明显低于单烧组，而ghrelin治疗后其分泌水平明显升高(P＜0.05);血管染色显示复合伤肉芽组织内血管形成数量明显减少，而ghrelin治疗则提高了微血管数量(P＜0.05)。WB实验证实生长因子TGF-β和VEGF分泌水平也出现类似“倒三角”变化趋势。其次，H.E.染色结果发现复合伤肉芽组织内WBC浸润量明显低于单烧组，而ghrelin治疗组WBC数目明显增加，主要以中性粒细胞和单核细胞为主。另外，通过对GHS-R1a进行染色发现，其在复合伤肉芽组织内表达量明显降低，而ghrelin可相对上调GHS-R1a表达。阻滞剂[D-Lys3]-GHRP-6的使用极大程度地削弱或抑制了ghrelin的上述效应。
　　3.放烧复合伤大鼠血清中促炎介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平在各个时间点均明显升高（与正常组比较，P＜0.05），ghrelin治疗发挥了显著的抑制作用（与复合伤组比较，P＜0.05）。炎症因子TNF-α是影响创面愈合的重要因素之一，伤后1，4，7d复合伤大鼠血清TNF-α浓度分别约是正常对照组的6，24和42倍(P＜0.05)，ghrelin治疗后第4，7d分别下降至原浓度的46％和61％(P＜0.05)。炎性信号分子检测方面，通过WB对各组大鼠腹腔巨噬细胞总蛋白进行分析发现:伤后第4天p38MAPK，JNK和p65NF-κB有最为显著的磷酸化增强，相反GR的表达则明显下调，ghrelin治疗后前三者磷酸化明显减弱，GR表达则显著上调。通过使用相应的蛋白抑制剂，在同一时间点发现: SB203580或SP600125单独使用可分别抑制p38MAPK、JNK的磷酸化，而联合使用则可同时抑制p38MAPK和JNK的磷酸化;SB203580，SB203580+SP600125均可阻碍p65NF-κB的磷酸化激活，而二者的单独或联合使用均可使GR表达明显增加，联合使用效果更好;Anti-TNF-α处理可明显抑制p38MAPK、JNK和p65NF-κB的磷酸化激活，上调GR表达，效果类似但不及ghrelin;在同一时间点ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α还显著降低了复合伤大鼠血清中TNF-α的分泌水平。创面愈合相关指标显示，ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α在伤后第24天均表现出更高的平均创面愈合率(35％～65％，P＜0.05)，且缩短了平均创面闭合所需时间(3～8d，P＜0.05)，但以ghrelin效果最佳。[D-Lys3]-GHRP-6的使用几乎完全抑制了ghrelin的上述作用。
　　4.GHS-R1a和α-SMA分别在复合伤大鼠创面成纤维细胞膜及胞浆内均有高水平表达，且分布均匀。增殖活性评价方面，不同剂量的Rat ghrelin(1-104ng/mL)均未能提高原代成纤维细胞的增殖能力;不同剂量的Rat TNF-α(1-100ng/mL)未能诱发细胞凋亡，细胞存活率无明显改变;ghrelin和TNF-α联合作用对其增殖活性亦无明显影响。“划痕实验”也显示，1-104ng/mL的ghrelin均不能促进“划痕”的愈合。在ghrelin的“促胶原分泌”相关机制研究方面，发现以下现象:TGF-β(5ng/mL)可使成纤维细胞内Smad3的磷酸化在刺激后0.5-1h显著增强(P＜0.05)，而TNF-α(5ng/mL)则可致Smad3的磷酸化在刺激后1-2h显著减弱(P＜0.05); ghrelin(1、100ng/mL)对TGF-β所致Smad3磷酸化的增强无影响;TNF-α引起成纤维细胞内p38MAPK和JNK的磷酸化水平显著增加(P＜0.05)，Smad3的磷酸化水平明显降低，而经ghrelin处理后p38MAPK和JNK的磷酸化受到明显抑制，反之Smad3的磷酸化水平则又有所恢复。
　　综上所述，ghrelin可加快放烧复合伤大鼠创面肉芽组织成熟从而剂量依赖性地促进创面愈合，其可能机制主要是:改善造血功能，增加肉芽组织WBC浸润及相关生长因子分泌，促进新生血管形成和胶原沉积;抑制MAPK炎性信号通路，促进GR表达或活化，减少炎性细胞促炎介质分泌，进而减弱全身炎性反应;抑制MAPK炎性信号通路，增强Smad3磷酸化，减轻TNF-α对创面成纤维细胞胶原分泌活性的抑制。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 Ghrelin对放烧复合伤大鼠创面的促愈效应观察

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 Ghrelin促进放烧复合伤大鼠创面肉芽组织形成和成熟

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 Ghrelin通过GHSR1a-MAPK-GR信号途径抑制炎性反应并促进放烧复合伤大鼠创面愈合

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 Ghrelin通过GHSR1a-MAPK-SMAD信号途径减轻TNF-α对放烧复合伤大鼠创面成纤维细胞胶原分泌活性的抑制

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 Ghrelin在放射复合伤中的应用前景

博士在读期间发表论文情况

致谢