冠心病血管内皮功能评价及相关影响因素的临床研究

摘要

冠心病（CHD）是一种严重威胁中老年人生命和健康的常见病，多发病。由于生活习惯和饮食结构的变化，目前更有年轻化的趋势。长期以来，评估冠心病血管病变严重程度主要依赖动脉造影、血管内超声等影像学手段。然而，血管病变严重程度不等同于其功能受损程度，相同病变程度的患者却常常有着不同的预后差异。依赖影像学评估制定血运重建治疗策略仅仅是冠心病治疗的一个起点，稳定并改善内皮功能才是延长患者生命、提高患者生活质量的关键。因此，内皮功能评价的临床地位越来越重要。
　　传统理论认为血管内皮功能的维持依赖循环内皮祖细胞（EPCs）的动员补充。EPCs的主要来源是骨髓。它具有自我更新、定向分化为内皮细胞的能力。循环EPCs具有血管受损时动员、归巢并再内皮化的能力，对血管损伤后的修复过程、血管内环境稳态维持具有重要意义。因此，计数循环中EPCs是评估损伤血管内皮修复潜力的重要指标。然而，检测循环EPCs数量主要依赖血液流式细胞术，由于易受多种因素的影响，只能间接反映血管内皮功能状态，因此也未能广泛应用于临床。目前，一种新的评估方法，也就是反应性充血外周张力法（PAT）测定外周动脉反应性充血指数（RHI），可无创、自动、数字化定量反映内皮细胞介导的舒张效应，弥补了冠脉造影、肱动脉超声等评价手段的不足。PAT技术在我国起步相对较晚，目前尚未完全用于临床检测。而内皮功能参数RHI与经典指标循环EPCs数量两者间的关系尚未见报道，两者与冠心病血管病变程度分层的相关性亟待探讨。为此，本研究对选择性冠脉造影患者测定其RHI和循环EPCs数量，并与冠心病危险因素及 SYNTAX评分所反映的冠脉病变分层程度进行分析，以期探讨其临床应用价值。
　　主要实验方法:
　　1．受试对象：本研究以2015年9月至2015年12月在第三军医大学第二附属医院心内科住院患者195例，其中男性117例，年龄范围平均年龄60岁，女性78例，平均年龄66岁。纳入标准：年龄大于18岁通过冠状动脉造影检查正常或冠心病患者（男女不限）。按照冠状动脉造影结果分为正常对照组（66例）和冠心病组（129例）。其中冠心病组又按照心脏外科与介入治疗狭窄冠脉研究（SYNTAX）积分法积分，并进一步分为低积分（70例）、中积分（38例）、高积分（21例）三个亚组。病例排除标准为：冠状动脉支架置入术后、冠状动脉搭桥术后、半年内有心脑血管意外事件（急性心肌梗死、脑出血、脑栓塞等）、生命体征不稳需要ICU治疗、恶性肿瘤、严重贫血、有包括外周动脉硬化、多发性动脉炎等血管疾病史、有血管介入治疗手术史、对造影剂、麻醉剂过敏、近期使用过硝酸酯类药物治疗以及不同意参与研究的病例。本研究已通过第三军医大学第二附属医院伦理委员会审核，入选病例均已对本研究知晓并签署知情同意书。
　　2．采集入组患者基本临床资料。收集并记录所有入选病例的临床信息，姓名、ID号、性别、年龄、身高、体重、血压、既往疾病史、服药史、吸烟饮酒史、家族史。入院后第二天抽血空腹静脉血，检测血常规、肝肾功、血脂、血糖；
　　3．反应性充血外周张力检测。所有病例在晨起未抽血、未服药、空腹状态下，采用无创反应性充血外周张力检测仪EndoPAT-2000(Israel)检测外周动脉内皮功能并测定RHI值。具体方法：受试者取平卧位，休息30分钟后，双上肢放松置于躯干两侧，非惯用侧上臂佩戴可充气袖带，双手食指各接探测指套，使用配套计算机系统为探测指套充放气，使其压力均匀充分作用于食指指端，内置传感器将指端血管床血流信号传入计算机，待血流信号稳定时即可开始测量。首先将指端血管床血流信号记为基线信号，记录5分钟；然后将袖带充气200mmHg以上，至指端血流信号消失记为阻断信号，记录5分钟；然后释放气袖，指端血流信号恢复，再记录5分钟。根据阻断前后指尖血流信号比，得出反应性充血指数值。根据双侧指尖信号比，控制非内皮依赖性的信号噪音；
　　4．流式细胞术检测外周血循环EPCs数量。所有受试者入院后采集晨起空腹血5 ml，血样置于肝素钠抗凝真空管中，室温保存。实验前，取200μl血样置于1.5 ml离心管中，先后加入2μl异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人CD34抗体（bs-8996R-FITC，北京博奥森）及2μl藻红蛋白（PE）标记的抗人VEGFR-2抗体（bs-0565R-PE，北京博奥森）双染色作为实验组；另取200μl血样置于离心管中，加入2μlPE标记的同型对照IgG蛋白（bs-0295P-PE，北京博奥森）作为对照组。上述样本混匀后避光静置1小时，然后加入800μl红细胞裂解液（Roche公司）混匀静置10分钟，以500×g离心3分钟，弃上清并使用1 ml细胞洗涤液（天津灏洋）洗涤细胞，再次以500×g离心3分钟，流式缓冲液500μl重悬细胞，上机（FACS Calibur,BD）检测计算EPCs在全血单核细胞中的比例；
　　5．冠状动脉造影检查及 SYNTAX积分。采用 Seldinger法穿刺，按以下投照体位（LAO+CRAN、LAO+CAUD、AP+CRAN、AP+CAUD、RAO+CRAN、RAO+CAUD）造影，以血管狭窄大于50％作为标准，采用SYNTAX（Synergy between PCI with TAXUS and Cardiac Surgury）积分法对多支血管进行积分并分组：<22分为低积分组，23-32分为中积分组，>33分为高积分组；
　　6．统计学分析。研究数据采用统计软件SPSS（版本号20.0，IBM公司）处理。冠心病组与对照组组间量值比较采用独立样本 t检验；不同 SYNTAX积分亚组组内及组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；不同因素水平间主效应分析采用双因素方差分析；频数采用χ2检验，相关性分析采用K-Pearson及Spearman检验；绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）并计算曲线下面积（AUC）和约登系数（Youden index）判定RHI、EPCs水平作为检验指标衡量冠心病及其危险分度的合理性及其决断值（cut-off value）。所有参数统计量用均数标准差（ x?s）表示，P<0.05表示有统计学意义。
　　主要实验结果:
　　一、基础资料的比较。对冠心病组及对照组受试者的年龄、体重指数（BMI）、收缩压、舒张压、血浆总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血浆尿素氮、肌酐、空腹血糖等生理生化指标进行了比较，组间无统计学差异。
　　二、RHI及循环EPCs数量与冠心病的相关性分析。与对照组比较，冠心病组RHI降低，循环EPCs数量减少，两个指标在两组间的差异均具有显著的统计学意义。受试195例中，循环EPCs数量与动脉RHI正相关，具有统计学意义。
　　三、RHI及循环EPCs数量在冠心病SYNTAX积分亚组中的比较。总体来看，随着SYNTAX积分的增高，冠心病者中RHI评分逐渐减小，循环EPCs数量也逐渐降低。SYNTAX积分组间比较，低积分组、中积分组和高积分组存在显著的统计学差异；组间比较来看，中积分组和高积分组RHI和循环EPCs数量均较低积分组明显降低，其差异具有显著的统计学意义，而中积分组与高积分组之间比较，无论是RHI指数还是循环EPCs数量均无统计学差异。
　　四、RHI及循环EPCs数量与冠心病危险因素的相关性分析。结果发现：①RHI与受试人群危险因素暴露数量密切相关。RHI在不同暴露数量的情况下分别为：1.78±0.58（0个），1.96±0.73（1个），1.69±0.32（2个）和1.55±0.47（3个以上）。组间比较有显著统计学差异。其中暴露数2个和3个以上的人群，RHI测值较暴露1个组显著下降，差异有统计学意义。②进一步地，我们分析了各类危险因素与测量指标的相关性：在总受试人群中，RHI与受试者是否存在糖尿病、高血压病有显著的统计学差异，表现为无糖尿病、高血压病者的RHI较有糖尿病、高血压病者高；另一方面，循环EPCs数量则与受试者是否具有高血压病和吸烟之间存在显著差异，表现为无高血压病、吸烟危险因素者较有上述因素者高。其他因素则无显著统计学意义。③进一步采用了双因素方差分析，将冠心病组与对照组再次分类统计，分析可能存在的主效应因素。结果发现；冠心病是影响RHI和EPCs在糖尿病、高血压、吸烟危险因素之间存在差异的主效应因素，另外，糖尿病也是RHI指标在冠心病组与对照组之间存在统计学差异的主效应因素。而吸烟、饮酒、高血压等则并不是本试验中RHI和EPCs在上述因素分组中存在差异的主效应因素。
　　五、RHI指数与循环EPCs数量作为冠心病评价指标的效果评价。结果发现：①RHI和循环中 EPCs水平均可作为预判是否冠心病的检查指标（AUCRHI=0.8，AUCEPC=0.781）。本研究中RHI预判冠心病的决断值为1.685，此时的敏感度为0.719，特异度为0.907；EPCs的阴性预判决断值为0.045%，此时的敏感度为0.875，特异度为0.705；②RHI可作为冠心病低积分状态预判的指标（AUC=0.868）。其中RHI预判低积分状态的阳性决断值为1.425，此时的敏感度为0.857，特异度为0.881；EPCs对低积分状态的预判稍差（AUC=0.624），其阳性决断值为0.0435%，此时的敏感度为0.429，特异度为0.814；③现有数据表明，RHI和循环EPCs数量尚不能作为中高积分状态的预判指标。④RHI与循环 EPCs具有显著正相关性。联合应用RHI与EPCs指标，联合ROC曲线AUC=0.889，此时的特异度为0.937，灵敏度为0.682，与单一使用RHI或EPCs指标评估比较，虽灵敏度稍有下降，但评估特异度明显更优。
　　主要结论：本研究中，无创性 PAT检查通过检测指端终末血管床舒张和血流变化的效应定量计算RHI，敏感度较超声进一步提高；同时通过阻断/释放血流对比前后，同步测试对侧指端信号，有效提高了信噪比，上述优点提示PAT检查可在临床推广应用。研究结果提示冠心病与内皮细胞功能不良密切相关，RHI和EPCs两指标者作为评估冠心病内皮功能受损的指标在应用中各有特点。RHI主要反映内皮舒张功能受损情况，EPCs则反映内皮修复功能储备情况。两指标下降均强烈提示血管内皮功能受损。RHI因由 PAT检查获得，其操作便利、无创、可直观反映血管内皮功能以及可靠的灵敏度和准确性较循环EPCs更有优势。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 资料与方法

2.1 临床资料

2.2 实验材料

2.3 研究方法

第三章 结果

3.1 基础资料的比较

3.2 RHI及循环EPCs数量在不同人群亚组的分析

3.3 与冠心病的相关性分析

3.4 RHI及循环EPCs数量在冠心病SYNTAX积分亚组中的比较

3.5 RHI及循环EPCs数量与冠心病危险因素的相关性分析

3.6 RHI指数与循环EPCs数量作为冠心病评价指标的效果评价

3.7 根据RHI指数分组后评估受试者的临床特点

3.8 RHI联合循环EPCs评估血管功能的相关性分析

第四章 讨论

全文结论

参考文献

文献综述: 血管内皮祖细胞在冠心病诊治中的研究应用进展

硕士在读期间发表的论文

致谢