Ⅱ型大麻素受体激活对新生儿脑出血的神经保护效应及机制研究

摘要

本研究使用Ⅶ型胶原酶诱导p7新生大鼠脑出血，模拟临床上新生儿脑出血(GMH)的病理生理特点，并通过影像学、行为学以及细胞生物学表现;针对GMH后脑小胶质细胞的形态转化以及相应生物学特点，以内源性大麻素受体(CB2R)作为干预靶点，探讨CB2R激活调控小胶质细胞表型转换以及与神经细胞相互作用的细胞、分子机制。1，为出血性脑卒中继发神经炎症的调控提供新靶点;2，为GMH及其后遗症的临床救治提供新思路;3，为防治GMH后神经炎症，改善预后提供新手段。
　　第一部分 Ⅱ型大麻素受体(CB2R)在新生儿脑出血后米诺环素介导的神经保护效应中的作用及机制研究
　　目的:
　　该部分研究为阐明米诺环素在新生儿GMH中的神经保护效应及其抗炎机制是否通过激活内源性CB2R实现。
　　材料与方法:
　　研究采用Ⅶ型胶原酶(0.3U)立体定向微量注射入p7幼鼠右侧生发基质层构建新生儿脑出血模型。通过腹腔注射米诺环素(45mg/kg)及选择性CB2R抑制剂(AM630，1mg/kg)或选择性激动剂(JWH133，1.5mg/kg)及相应安慰剂组干预共198只幼鼠，使用免疫组织化学、免疫印迹技术以及ELISA技术等检测内源性CB2R、小胶质细胞以及相应炎症因子，如IL-6，TGF-β以及TNF-α蛋白含量，使用PCR技术检测相关mRNA水平，使用小动物MRI技术检测各组幼鼠脑皮层厚度及脑室扩张体积。
　　结果:
　　腹腔注射米诺环素能增加GMH24小时后CB2R表达量，同时减少早期神经炎症因子的释放，减轻幼鼠脑含水量以及活化小胶质细胞数;28天7.0T MRI T2加权像提示米诺环素可显著减轻GMH诱导的脑室体积扩大以及增加幼鼠脑皮层厚度。使用CB2R选择性抑制剂AM630在诱导GMH前1小时腹腔注射可显著逆转米诺环素的神经保护效应。
　　结论:
　　研究发现米诺环素具有减轻GMH后早期脑水肿，抑制神经炎症等保护效应，当使用CB2R选择性抑制剂时米诺还素的神经保护效应被抑制，证实米诺环素可能是通过上调细胞膜蛋白CB2R的表达发挥神经保护效应，为GMH及其并发症提供新的研究靶点。
　　第二部分 外源性激活CB2R改善GMH后继发炎症脑损伤的作用及机制研究
　　目的:
　　通过体内外研究证实外源性激活CB2R对GMH后小胶质细胞增殖、分化的作用以及MAPK/ERK的磷酸化在该过程中的作用。
　　材料与方法:
　　在GMH幼鼠模型的基础上，腹腔注射CB2R选择性抑制剂(AM630，1mg/kg)或CB2R选择性激动剂（JWH133，1.5mg/kg）。检测内源性大麻素受体激活后GMH介导的幼鼠脑水肿变化（脑水含量）、神经元凋亡以及小胶质细胞MAPK/ERK信号通路磷酸化情况;离体培养原代小胶质细胞，使用凝血酶（Thrombin，红细胞裂解产物之一）作为至伤物构建离体脑出血单一因素环境，观察小胶质细胞在凝血酶以及JWH133干预后的增殖情况以及MAPK/ERK信号通路磷酸化程度。
　　结果:
　　腹腔注射CB2R选择性激动剂JWH133与注射米诺环素具有相似的神经保护效应，如减轻GMH诱导的脑水肿以及减轻脑室扩张，减少血肿周围小胶质细胞增殖、分化，同时JWH133能减少血肿周围神经元的凋亡。通过在体与离体实验观察，发现JWH133能抑制MAPK/ERK蛋白磷酸化水平，进而减少活化小胶质细胞增殖、分化。
　　结论:
　　外源性激活CB2R通过抑制GMH后小胶质细胞MAPK/ERK磷酸化水平，减少激活小胶质增殖、分化，同时减少神经炎症因子的释放并干预继发性脑损伤。该研究进一步阐明CB2R在GMH后的神经保护机制，为CB2R选择性激动剂的临床转化提供理论依据。
　　第三部分 CB2R选择性激动剂促进GMH后神经修复的作用及机制研究
　　目的:
　　该部分拟证实CB2R选择性激动剂(JWH133)是否能在GMH后增加CX3CR1阳性小胶质细胞数量，并上调脑源性神经营养因子(B DNF)释放，促进神经再生。
　　材料与方法:
　　在CB2R选择性抑制或激活的基础上，幼鼠脑室内立体定向微量注射CX3CR1shRNA(预先构建)。使用Brdu、M1小胶质细胞以及M2小胶质细胞特异性marker-CD68/CD206等检测不同干预后小胶质细胞形态变化。使用7.0T MRI-DTI检测CB2R激活后神经纤维束损伤程度，再使用免疫荧光以及Western Blot技术观察小胶质细胞与神经元前体细胞(Neuronal precursor cells，NPCs)的相互作用以及神经元前体细胞增殖等。
　　结果:
　　在JWH133治疗GMH幼鼠的基础上，早期脑室内注射CX3CR1 shRNA以下调神经系统CX3CR1表达，发现JWH133能减少M1型(CD68)活化小胶质细胞的增殖，同时增加M2型(CD206)小胶质细胞增殖，进一步发现JWH133通过增加小胶质细胞CX3CR1膜蛋白水平，促进小胶质下拨向M2形态转换，并释放大量神经营养因子，如脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子(IGF)等，促进GMH损伤的神经纤维束修复以及神经元前体细胞增殖、分化。
　　结论:
　　研究证实CB2R选择性激动剂促进M1小胶质细胞向M2形态转换，释放神经营养因子，促进损伤的神经系统修复。本研究证实CB2R激活是小胶质细胞在病理状态下自我调控机制启动的结果，如果人为加以干预，激活CB2R可达到抑制小胶质细胞激活诱导的神经炎症，同时调控小胶质细胞从细胞毒型向神经保护型转换。该研究为出血性脑卒中后继发炎症损伤提供新的研究思路，为新生儿脑出血及其并发症的临床救治提供新策略。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 CB2R在新生儿脑出血后米诺环素神经保护效应中的作用及机制研究

2．1 研究背景

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 外源性激动CB2R减轻新生儿脑出血后继发炎症脑损伤的机制研究

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 选择性CB2R激动剂在新生儿脑出血后调控小胶质细胞形态转换，促进神经修复的作用及机制研究

4．1 研究背景

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 新生儿生发基质-脑室内出血的临床及基础研究概述

文献综述二 新生儿GMH-IVH及其并发症防治策略及研究方向

攻读学位期间的研究成果

致谢