AMPK对成肌细胞功能活性的影响及其代谢调节研究

摘要

背景和目的:
　　肌卫星细胞是骨骼肌组织内最主要的干细胞成分，它通过激活转化为具有增殖分化能力的成肌细胞负责骨骼肌的生后生长和损伤后再生，是骨骼肌损伤再生和可塑性的主要细胞基础。近几年研究显示细胞能量代谢在干细胞的自我更新、增殖分化中具有重要调控作用，肌卫星细胞在增殖分化进程中也呈现了显著的能量代谢模式的改变。腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)是细胞内能量代谢的关键感受和调控分子，活化的AMPK一方面抑制消耗ATP的合成代谢途径，同时启动产生ATP的细胞内分解代谢，最终恢复或维持细胞能量代谢的平衡。本课题以AMPK为研究重点，首先观察了激活AMPK对成肌细胞C2C12增殖分化及线粒体功能活性等性状的影响，然后基于前期报道观察了热量限制对老年骨骼肌及肌卫星细胞AMPK信号通路的调节。以深入阐明代谢因素参与干细胞功能调节的可能机制，探讨AMPK信号途径对骨骼肌卫星细胞增殖分化潜能的调节作用，发掘促进老年骨骼肌组织损伤再生的潜在分子靶位。
　　方法:
　　1.C2C12细胞的培养
　　C2C12成肌细胞株购自美国ATCC公司，细胞生长培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，分化培养基为含2％马血清的低糖DMEM培养基，培养箱温度37℃，CO2浓度5％。
　　2.二甲双胍处理后C2C12细胞AMPK通路相关蛋白表达的检测
　　C2C12细胞在含二甲双胍（终浓度1mmol/L）的生长培养基中分别培养12h、24h、36h和48h后，WB检测p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表达变化。
　　3.诱导AMPK活化后C2C12细胞增殖能力的检测
　　C2C12细胞在含二甲双胍（终浓度1mmol/L）的生长培养基中培养，CCK-8细胞增殖实验分别检测培养0h、24h、48h后细胞增殖状态，流式细胞周期分别检测培养24h和48h后细胞周期的变化，同时以5-乙炔基-2-脱氧尿昔(Edu)掺入实验检测培养48h后DNA合成情况。
　　4.诱导AMPK活化后C2C12细胞肌原性转录因子表达及肌管形成的检测
　　(1) C2C12细胞在含二甲双胍（终浓度1mmol/L）的生长培养基中培养，WB分别检测培养12h、24h、36h和48h后细胞Pax7蛋白表达变化，Real-Time PCR分别检测培养24h和48h后细胞MyoD mRNA表达变化。
　　(2) C2C12细胞首先在含二甲双胍（终浓度1mmol/L）的生长培养基中预处理48h，然后在分化培养基条件下诱导其分化，通过Real-Time PCR分别检测诱导24h、48h和72h后Myogenin mRNA的表达，同时以吉姆萨染色检测诱导72h后肌管形成情况，计算肌管融合指数（含2个以上细胞核的肌管比例）。
　　5.诱导AMPK活化后C2C12细胞线粒体膜电位的检测
　　C2C12细胞在含二甲双胍（终浓度1mmo l/L）的生长培养基中培养，通过流式细胞仪以JC-1线粒体膜电位探针分别检测培养24h和48h后细胞线粒体膜电位变化，同时以四甲基罗丹明乙酯(TMRE)线粒体膜电位探针于激光共聚焦显微镜下检测培养24h后细胞线粒体膜电位变化。
　　6.诱导AMPK活化后C2C12细胞线粒体分布、生成以及PGC1α表达的检测
　　C2C12细胞在含二甲双胍（终浓度1mmol/L）的生长培养基中培养，通过Mito-Tracker Green探针标记细胞线粒体，然后通过激光共聚焦和流式分别检测细胞线粒体分布及生成情况。同时以WB检测细胞PGC1α蛋白表达变化，以Real-Time PCR分别检测细胞PGC1αmRNA表达变化。
　　7.热量限制动物模型的建立
　　13月龄雄性C57BL/6小鼠30只，按照简单随机抽样法分为两组:自由进食组和40％热量限制组，单笼饲养，自由饮水，一只热量限制小鼠一周进食量=自由进食组小鼠平均每只一周进食量×60％，平均分至每天，热量限制12周。
　　8.热量限制后小鼠骨骼肌AMPK通路相关蛋白表达的检测
　　WB检测热量限制后小鼠胫前肌p-AMPKα、AMPKα和SIRT1蛋白表达变化。
　　9.热量限制后小鼠骨骼肌线粒体形态的观察以及PGC1α蛋白表达的检测
　　透射电镜观察热量限制后胫前肌线粒体形态的变化，分别计算线粒体的密度、长度及宽度，WB检测胫前肌PGC1α蛋白表达变化。
　　10.热量限制后小鼠骨骼肌卫星细胞AMPK通路相关蛋白表达的检测
　　肌卫星细胞的分离通过胶原酶和中性蛋白酶消化，然后通过多重荧光标记进行流式分选，其中CD45-/CD11b-/Sca-1-/CXCR4+/CD29+细胞为肌卫星细胞;分选的细胞提取总蛋白，然后通过ELISA分别检测p-AMPKα、SIRT1和PGC1α表达变化。
　　结果:
　　1.C2C12细胞在二甲双胍处理24h后，AMPKα的磷酸化水平即显著升高(p＜0.05);SIRT1蛋白表达在处理组显著上调，处理48h后与对照组差异最为明显(p＜0.05)。
　　2.二甲双胍诱导AMPK活化后，通过CCK-8实验观察显示C2C12细胞增殖速度明显减慢，OD450nm在48h时较对照组显著下降(p＜0.01);同时细胞周期也表现出明显变化，S期细胞比例随处理时间不断升高，48h时较对照组差异显著(p＜0.05)，而G2/M期细胞比例则不断减少;DNA合成检测结果显示，Edu阳性细胞比例在二甲双胍处理48h后与对照组相比增加明显(p＜0.01)。
　　3.二甲双胍处理24h后，C2C12细胞Pax7蛋白表达较对照组显著升高(p＜0.01)，并在此后的处理期间一直维持较高表达水平;MyoD mRNA表达在处理48h后，与对照组相比下降明显(p＜0.01);C2C12细胞通过二甲双胍预处理后，分化条件下Myogenin mRNA的表达在各检测点均较低，诱导72h后，Myogenin mRNA表达和肌管融合指数较对照组均显著下降（均为p＜0.01）。
　　4.通过两种不同线粒体膜电位探针检测结果显示，二甲双胍处理24h后C2C12细胞线粒体膜电位较对照组下降明显（均为p＜0.01）。
　　5.Mito-Tracker Green标记检查结果可以明显的观察到二甲双胍处理48h后C2C12细胞线粒体趋向核周聚集分布，同时线粒体平均荧光强度较对照组显著升高(p＜0.01);蛋白及mRNA检测结果显示，与对照组相比，C2C12细胞在二甲双胍处理24h后PGC1α蛋白表达和mRNA表达均显著升高（分别为p＜0.01和p＜0.05）。
　　6.与对照组相比，热量限制小鼠骨骼肌AMPKα磷酸化水平显著上调(p＜0.01)，SIRT1蛋白表达也明显升高(p＜0.01)。
　　7.与对照组相比，热量限制鼠骨骼肌线粒体密度明显升高(p＜0.01)，体积明显增大（长度:p＜0.05，宽度:p＜0.01）;同时PGC1α蛋白表达也显著上调(p＜0.05)。
　　8.热量限制鼠肌卫星细胞p-AMPKα、SIRT1以及PGC1α表达较对照组均明显升高（分别为p＜0.01; p＜0.05; p＜0.05）。
　　结论:
　　1.二甲双胍能够激活C2C12细胞AMPK信号通路，促进其下游去乙酰化酶SIRT1等蛋白表达的上调。
　　2.二甲双胍能够抑制C2C12细胞增殖，使其细胞周期阻滞于S期;同时能够上调Pax7蛋白的表达，下调MyoD基因的转录水平，在分化培养基诱导条件下抑制其定向分化，从而维持C2C12细胞的低分化状态。这些影响可能依赖于二甲双胍处理后C2C12细胞内AMPK通路的活化及其相关蛋白表达的上调。
　　3.通过二甲双胍激活AMPK能够引起C2C12细胞线粒体膜电位的下降，提示细胞能量代谢水平的下调;同时伴随PGC1α转录和蛋白表达的上调，线粒体生成增多且呈现向核分布。进一步提示二甲双胍可能通过AMPK的活化及相关蛋白表达的上调维持C2C12细胞的静息状态。
　　4.热量限制能够激活骨骼肌AMPK通路，上调AMPK相关蛋白表达，促进骨骼肌内线粒体生成，从而改善老年骨骼肌微环境，同时还能促进肌卫星细胞内AMPK通路的上调。结合前期研究，提示热量限制可能通过上调AMPK通路维持老年肌卫星细胞干细胞属性。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 诱导AMPK活化对C2C12细胞增殖分化的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 诱导AMPK活化对C2C12细胞线粒体功能活性的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 热量限制对老年骨骼肌组织及肌卫星细胞AMPK信号通路的影响

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

全文总结

参考文献

文献综述 AMPK与骨骼肌能量代谢及发育再生

攻读硕士学位期间发表文章

致谢