静脉表型分子COUP-TFⅡ调节血管内皮细胞衰老的作用及机制

摘要

动脉粥样硬化是造成心脑血管疾病和外周血管病的重要原因，是现代社会致死，致残，严重影响人类健康和生活质量的主要因素之一。动脉粥样硬化好发于动脉，静脉与动脉同处于一个血管系统中，然而静脉却未见粥样硬化。虽然与血流动力学等因素有关，但静脉和动脉本身分子表型就不同，目前尚不清楚动静脉对粥样硬化易感性的差异，除受血流动力学等环境因素影响外，是否还与血管本身分子表型有关。
　　目的：
　　本研究旨在观察特异表达于静脉内皮的COUP-TFⅡ对血管内皮细胞衰老和增殖的影响及可能的信号和分子机制。
　　方法：
　　1.培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)，采用PCR方法检测COUP-TFⅡ基因在离体HUVEC和HCAEC的表达水平的差异。
　　2.通过转染COUP-TFⅡ-siRNA使HUVEC的COUP-TFⅡ表达降低，观察COUP-TFⅡ对血管内皮细胞衰老增殖的影响。AngⅡ(10-5 mol/L)诱导48小时后，利用β-半乳糖苷酶(β-gal)细胞染色，荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)和Western blot检测衰老相关基因P53的蛋白表达情况，观察COUP-TFⅡ对HUVEC衰老的影响。利用CCK-8和细胞计数法检测HUVEC的增殖情况。
　　3.为了进一步探究Akt信号对COUP-TFⅡ调控血管内皮细胞衰老的影响，利用Western blot检测了Akt/p-Akt的蛋白表达变化情况;加入Akt激动剂SC79后，用β-gal细胞染色和荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的方法检测HUVEC的衰老率、Western blot检测衰老相关基因P53的蛋白表达变化情况;用CCK-8法、细胞计数法检测HUVEC增殖的变化情况，观察Akt信号与COUP-TFⅡ对血管内皮细胞衰老和增殖影响的可能机制。
　　4.为了进一步探究胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)对COUP-TFⅡ调控血管内皮细胞衰老的影响，利用Western blot检测了IGFBP-1的蛋白表达变化情况;加入IGFBP-1蛋白后，用β-gal细胞染色和荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的方法检测HUVEC的衰老率、Western blot检测衰老相关基因P53的蛋白表达变化情况;用CCK-8法、细胞计数法检测HUVEC增殖的变化情况，观察IGFBP-1分子与COUP-TFⅡ对血管内皮细胞衰老和增殖影响的可能机制。
　　5.利用microRNA(miRNA)芯片技术探究COUP-TFⅡ对miRNA表达谱的调控影响。在无AngⅡ诱导下，分别提取3个Control组和si-COUP-TFⅡ组细胞样本的RNA后，由华大基因公司进行miRNA OneArray(@)芯片检测及分析。
　　结果：
　　1.与Control组相比，通过COUP-TFⅡ小干扰RNA转染降低HUVEC细胞COUP-TFⅡ表达后，能够显著促进AngⅡ诱导的内皮细胞衰老:我们分别检测了内皮细胞β-gal细胞染色的阳性细胞率、荧光探针DCFH-DA的ROS阳性细胞率和Western blot的P53蛋白表达。在AngⅡ为0 mol/L时，发现与Control组相比，si-COUP-TFⅡ组β-gal染色阳性率（0.0622±0.0192vs0.0665±0.0132;P＞0.05）、ROS阳性细胞率(0.0931±0.0111vs0.1120±0.0125; P＞0.05)、P53蛋白表达（1.0000±0.0544vs0.9870±0.0794;P＞0.05）均无显著差异;在AngⅡ为10-5mol/L时，发现与Control组相比，si-COUP-TFⅡ组β-gal染色阳性率增高(0.4390±0.0673 vs0.8107±0.0452;P＜0.05)、ROS阳性细胞率增高(0.1536±0.0145 vs0.3306±0.0532; P＜0.05)、P53蛋白表达增高(1.0000±0.0956 vs1.4142±0.0633; P＜0.05)。
　　2.与Control组相比，通过COUP-TFⅡ小干扰RNA转染降低HUVEC细胞COUP-TFⅡ表达后，能够显著抑制AngⅡ诱导的内皮细胞增殖:我们分别检测了内皮细胞在450nm的相对OD值和细胞计数值。在AngⅡ为0 mol/L时，发现与Control组相比，si-COUP-TFⅡ组的相对OD值(1.0000±0.0272vs0.9839±0.0315; P＞0.05)、细胞计数值((1.0417±0.0892)×105 vs(1.0938±0.0970)×105, P＞0.05）均无显著差异;在AngⅡ为10-5mol/L时，发现与Control组相比，si-COUP-TFⅡ组的相对OD值降低（1.0000±0.0808 vs0.5743±0.0567; P＜0.05）、细胞计数值降低（（3.5188±0.0963）×105vs(2.0875±0.0973)×105; P＜0.05)。
　　3.Akt激动剂SC79(4ug/ml)能够部分逆转COUP-TFⅡ调节内皮细胞衰老增殖的影响:我们分别检测了内皮细胞β-gal细胞染色的阳性细胞率、荧光探针DCFH-DA的ROS阳性细胞率和Western blot的P53蛋白表达。在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，发现加入Akt激动剂SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79组的β-gal染色阳性率降低(0.4436±0.0488 vs0.7558±0.0667 vs0.5154±0.0213; P＜0.05)、 ROS阳性细胞率降低(0.1325±0.0221 vs0.3404±0.0383 vs0.2133±0.0205, P＜0.05)、 P53蛋白表达降低(1.0000±0.0665 vs1.4985±0.0710 vs1.0818±0.0603;P＜0.05);检测内皮细胞在450nm的相对OD值和细胞计数值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，发现加入Akt激动剂SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79组的相对OD值增高(1.0000±0.0613 vs0.5940±0.0296vs0.8250±0.0385; P＜0.05)、细胞计数值增高（（4.3667±0.0933）×105 vs(1.6417±0.0969×105 vs(2.6958±0.0966)×105, P＜0.05)。
　　4.IGFBP-1(100ng/ml)蛋白能够部分逆转COUP-TFⅡ调节内皮细胞衰老增殖的影响:我们分别检测了内皮细胞β-gal细胞染色的阳性细胞率、荧光探针DCFH-DA的ROS阳性细胞率和Western blot的P53蛋白表达。在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，发现加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1组的β-gal染色阳性率降低(0.2121±0.0412 vs0.6423±0.0286 vs0.2616±0.0318; P＜0.05)、 ROS阳性细胞率降低(0.1382±0.0110 vs0.3357±0.0242 vs0.2620±0.0379,P＜0.05)、 P53蛋白表达降低(1.0000±0.1018 vs1.4626±0.0459 vs1.1167±0.0481; P＜0.05);检测内皮细胞在450nm的相对OD值和细胞计数值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，发现加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1组的相对OD值增高(1.0000±0.0717 vs0.6051±0.0626vs0.9058±0.0607; P＜0.05)、细胞计数值增高((4.4667±0.0707)×105 vs(2.1583±0.0905)×105vs(3.6271±0.0898)×105, P＜0.05)。
　　5.抑制内皮细胞COUP-TFⅡ的表达后，共有27个miRNAs发生了显著的差异表达，其中表达上调的有21个miRNAs，而表达下调的有6个miRNAs。在这些差异变化的miRNAs中，miR-642a-3p与脂质代谢有关;miR-513a-5p、miR-130a-3p、miR-221-3p和miR-652与炎症反应有关;而miR-196a、miR-1247、miR-92b和miR-363-5p与细胞增殖有关。
　　结论：
　　1.抑制静脉内皮表型分子COUP-TFⅡ表达时，能促进AngⅡ诱导的静脉内皮细胞衰老、抑制其增殖，提示COUP-TFⅡ对内皮细胞衰老具有保护作用，其分子机制可能与其调节Akt信号和IGFBP-1分子的表达有关。
　　2.抑制COUP-TFⅡ表达能改变静脉内皮miRNAs的表达谱，主要涉及炎症、脂质代谢、细胞增殖等方面，提示COUP-TFⅡ可能通过调节miRNAs的表达进而影响血管粥样硬化易感性。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 抑制COUP-TFⅡ表达对血管内皮细胞衰老与增殖的影响及与Akt信号的关系

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 IGFBP-1逆转COUP-TFⅡ调节内皮细胞衰老的作用

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 COUP-TFⅡ对血管内皮细胞MicroRNA表达谱的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述

攻读硕士期间发表的论文

致谢