自噬与MALAT1在ox-LDL介导血管细胞增殖中的作用及机制研究

摘要

目的：
　　目前，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，有统计显示农村为44.6％，城市为42.51％。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。在心血管病中动脉粥样硬化(Athero slerosis，AS)严重危害人类健康。在AS形成过程中血管内膜的损伤是其始动环节，内皮通透性、黏附性和血液凝固性的改变及所释放的大量细胞因子导致血管壁发生一系列连锁反应，从而导致血管壁结构的改变。具体表现为内膜的脂质浸润、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和巨噬细胞迁移和泡沫细胞的形成其中，VSMC是增殖体系中最活跃的细胞。即内皮细胞的损伤和VSMC的异常增殖是AS发生发展过程中两个重要环节，所以针对内皮损伤的修复及VSMCs异常增殖的防治能促进血管损伤的修复，对于AS的预防和治疗至关重要。而内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)被认为是内皮细胞损伤后修复的关键细胞。所以我们的研究是基于在AS危险因素——氧化低密度脂蛋白(oxide lowdensity lipoprotein，ox-LDL)环境下，分两部分对EPCs和VSMCs增殖能力的变化和相关机制进行探索。
　　第一部分 自噬在氧化低密度脂蛋白诱导的EPCs增殖中的作用
　　EPCs在1997年被首次发现并且命名。之后的研究发现，EPCs有改善内皮功能，增加血管新生的作用，并且揭示了高脂血症、高血压等AS相关高危因素与EPCs数量的减少密切相关，EPCs数量的减少还可以作为AS进展的独立危险因素。在动物模型中，如兔的脑缺血模型、大鼠急性肾损伤模型等，基于EPCs移植相关的研究也发现EPCs可以改善缺血造成的损伤。但是移植研究距离临床应用还有较大距离。所以在应激环境下，提高EPCs的生存至关重要。
　　自噬是机体在应激环境下产生的一种以高效节约体内物质为基础的自我保护行为。研究发现自噬可以降低凋亡并且维持细胞活性。2011年，科学杂志的一项研究进一步从机制层面揭示了自噬的抗凋亡作用可以通过上调抗凋亡蛋白和清除促凋亡蛋白实现。目前，自噬在心血管系统的内皮细胞、VSMC、心肌细胞等中都有研究，但是自噬对于EPCs的相关研究还比较少见。所以我们的研究旨在通过ox-LDL刺激EPCs，从而观察自噬对EPCs增殖能力的影响。
　　第二部分 长链非编码RNA MALAT1在氧化低密度脂蛋白诱导的VSMCs增殖中的作用及机制
　　AS是引起心脑血管疾病的重要因素，这与VSMCs的增殖密切相关。在AS发生发展中，内皮细胞的损伤作为触发点，之后引起一系列改变，导致炎症因子分泌等，最终，造成管腔狭窄的主要细胞成分是异常增殖的VSMC。此外，动脉壁中膜VSMC的增殖或肥大是高血压血管壁增厚的主要原因。所以，针对针对VSMCs异常增殖的研究对于AS及高血压等疾病的防治至关重要。
　　长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA) MALAT-1又名核富集常染色体转录产物2(Nuclera-enriched autosomaltranscript2，NEAT2)属长链非编码RNA家族的重要成员，最早于2003年在非小细胞肺癌研究中被发现。MALAT1在多种组织中表达。近几年的研究也发现，在高糖、缺氧环境下MALAT1可影响血管内皮细胞的功能。然而MALAT1对于与心血管疾病密切相关的VSMCs的作用目前尚未见报道。因此我们旨在通过ox-LDL刺激VSMCs来研究MALAT1对VSMCs增殖的影响，并探索可能的分子机制。
　　方法：
　　第一部分
　　1.1 我们首先进行了EPCs的培养、鉴定。分离并研碎大鼠脾脏后，用密度梯度离心后将获得的细胞进行培养，待细胞贴壁后在镜下观察细胞形态，并用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双染法进行鉴定。
　　1.2 采用同样的方法获得EPCs，并将EPCs接种至E-plate8细胞培养板中，使用不同浓度（0μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、100μg/ml）的ox-LDL处理EPCs，继续培养，使用实时细胞分析技术(real time cellular analysis，RTCA)检测各组细胞的增殖活性。
　　1.3 使用同上浓度的ox-LDL处理EPCs后，并在不同时间点(0h、6h、12h、18h、24h)提取各组EPCs总蛋白，使用western blot技术进行分析能够反映自噬水平的p62蛋白的相对表达水平。
　　第二部分
　　2.1 我们首先培养了人冠状动脉VSMC，不同浓度（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）ox-LDL处理细胞，使用CCK8检测VSMC增殖能力的变化。
　　2.2 并且在不同浓度ox-LDL处理细胞后提取总RNA，使用实时荧光定量PCR检测不同组间的MALAT1的表达变化。
　　2.3 合成人源性小干扰RNA(si-malat1)，并转染VSMCs细胞，抑制MALAT1的表达。使用实时荧光定量PCR检测转染效率。
　　2.4 使用CCK8检测转染后细胞增殖能力的变化，并且比较si-malalt1组和si-malalt1+ox-LDL组增殖能力的变化。
　　2.5 使用western blot技术检测增殖相关蛋白p-AKT/AKT在ox-LDL处理、si-malalt1处理及si-malalt1干扰后加ox-LDL处理后各组的表达。
　　2.6 在si-malat1处理细胞后，给予AKT激动剂(SC-79)用CCK8法观察VSMC增殖能力的变化。
　　2.7 使用小干扰RNA(si-stim1)处理细胞后，用western blot技术检测p-AKT/AKT的表达，用CCK8检测其对细胞增殖的影响。
　　2.8 使用si-malat1处理细胞，提取蛋白，检测STIM1的表达。在共聚焦显微镜下结合TG及CaCl2检测钙内流情况。
　　结果：
　　第一部分
　　1.1 成功分离培养EPCs，培养的细胞延伸似梭形，呈典型的EPCs形态。双染法阳性细胞可达85％。
　　1.2 ox-LDL呈浓度依赖性地抑制EPCs的增殖活性。
　　1.3 ox-LDL呈浓度和时间依赖性地抑制p62的表达。
　　1.4 shAtg7和3-MA抑制自噬，也可以在ox-LDL环境下进一步抑制EPCs的增殖。
　　第二部分
　　2.1 ox-LDL呈浓度和时间依赖性地促进VSMCs的增殖能力。
　　2.2 ox-LDL呈浓度依赖性地促进MALAT1的表达。
　　2.3 敲减MALAT1可逆转ox-LDL对VSMCs的促增殖作用。
　　2.4 抑制MALAT1可降低ox-LDL诱导的AKT磷酸化。
　　2.5 抑制MALAT1可减少AKT激动剂对VMSCs的促增殖作用。
　　2.6 抑制MALAT1可抑制STIM1及钙库操纵性钙内流。
　　2.7 抑制STIM1也抑制AKT磷酸化及VSMCs增殖。
　　结论：
　　第一部分 自噬在氧化低密度脂蛋白诱导的EPCs增殖中的作用
　　1.1 ox-LDL抑制EPCs增殖的同时也促进了其自噬水平。
　　1.2 自噬可减轻ox-LDL对EPCs增殖的抑制作用。
　　第二部分 长链非编码RNA MALAT1在氧化低密度脂蛋白诱导的VSMCs增殖中的作用及机制
　　2.1 ox-LDL可增加MALAT1的表达，同时也促进了VSMCs的增殖。
　　2.2 MALAT1可通过调节AKT的磷酸化，参与ox-LDL对VSMC的促增殖作用。
　　2.3 MALAT1可以通过影响STIM1而影响钙内流及AKT活性，从而影响VSMCs的增殖能力。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 自噬在ox-LDL对EPCs增殖影响中的作用

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 MALAT1在ox-LDL对VSMCs增殖影响中的作用及机制

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 非编码RNA对自噬的调节在心血管疾病中的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢