Vγ4+γδ+T细胞对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎的影响研究

摘要

银屑病是一种常见病，其中最常见的类型为寻常型银屑病，临床主要表现为鳞屑性红斑。遗传、感染、内分泌紊乱、免疫系统异常等多种致病因素均可导致银屑病的发生;皮损好发于面部、躯干及四肢，易反复，严重影响患者的身心健康。
　　T细胞主要参与细胞免疫，在识别抗原、分化为效应细胞以及记忆细胞等方面有着极其重要的作用。分化的效应细胞具有分泌淋巴因子并与靶细胞结合发挥免疫效应的作用，分化的记忆细胞具有分化成效应T细胞的功能，这使得T细胞能够保护机体免于感染、物理、化学等多方面的伤害。也正是由于T细胞具有重要的防御作用，因此T细胞参与的细胞免疫系统的紊乱与异常将导致自身免疫系统疾病发生的发生，如银屑病、系统性红斑狼疮、天疱疮等。虽然目前对于这些免疫系统疾病的研究有很多，但关于Vγ4+γδ+T细胞在表皮内对银屑病发病的作用国内外均未见报道。
　　由于前期的文献已报道Vγ4T细胞对银屑病样皮炎有促进作用，结合前期预实验结果:清除BABL/c鼠体内的Vγ4T细胞后，咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎减轻。在本课题中，利用Vγ4T细胞清除鼠，探讨Vγ4+γδ+T细胞在表皮内对银屑病样皮炎的作用;同时探讨了第二次利用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎后真皮内的Vγ4+γδ+T细胞对银屑病样皮炎的影响。我们推测在Vγ4T细胞清除鼠，无论是第一次利用咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样皮炎还是第二次利用咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎均会减轻。
　　目的：
　　本课题研究拟通过构建不同状态下的小鼠银屑病样皮炎模型，探索Vγ4T细胞在银屑病样皮炎中发挥作用的机理，为进一步明确银屑病发病机制提供新的思路。
　　方法：
　　1.分组及构建Vγ4清除鼠
　　雌性6-8周C57BL/6鼠随机分为两组，即野生组、Vγ4清除组;Vγ4清除组采用腹腔注射Vγ4清除抗体，野生组采用腹腔注射等体积PBS缓冲液;Vγ4清除组真皮内使用流式细胞仪检测不出Vγ4T细胞即为建模成功。
　　2.构建咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎模型
　　小鼠背部脱毛区域连续6天涂抹咪喹莫特乳膏（60mg/只/天）诱导银屑病样皮炎，采用国际化PASI评分标准对每只小鼠的银屑病样皮炎严重程度进行评分，HE染色观察皮损表皮组织的厚度及炎性细胞浸润的程度;
　　3.Vγ4T细胞在表皮内对银屑病样皮炎的影响及其机理研究
　　3.1构建银屑病样皮炎模型后，通过Western blot技术检测野生组小鼠表皮组织内IL-17的表达;通过流式细胞仪技术分别检测野生组表皮内IL-17A+γδ+T细胞、Vγ4+γδ+T细胞以及IL-17A+Vγ4+T细胞的数量;
　　3.2通过银屑病的PASI评分标准以及病理HE染色评估两组小鼠的皮炎变化，利用流式细胞仪检测Vγ4T细胞清除组小鼠表皮细胞内Vγ4+γδ+T细胞、表皮细胞胞内的IL-17A分泌情况;
　　3.3通过免疫组化技术检测小鼠表皮内IL-23、IL-1β的表达，之后中和小鼠皮下IL-23、IL-1β并比较其与野生型正常小鼠皮炎的变化;同时检测健康皮肤与银屑病患者皮损内IL-23、IL-1β的表达;
　　4.小鼠真皮内Vγ4T细胞对第二次利用咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的影响及机理研究
　　4.1通过银屑病的PASI评分标准以及组织病理HE染色评估:野生组第一次利用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎组与野生组第二次利用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎组，两组小鼠的炎症程度;利用流式细胞仪技术检测两组小鼠真皮内Vγ4T细胞以及其分泌的IL-17A、γ-IFN、IL-22;
　　4.2第二次诱导银屑病样皮炎前清除小鼠体内的Vγ4T细胞，外用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎模型后，观察其与野生组第二次诱导的银屑病样皮炎的不同;采用流式细胞仪技术检测两组小鼠真皮内分泌的IL-17A、γ-IFN、IL-22;
　　结果：
　　1.成功构建了Vγ4清除鼠模型;
　　2.连续6天涂抹0.5％咪喹莫特乳膏后，野生组小鼠背部脱毛区域出现红斑、鳞屑、斑块的典型银屑病样皮损比Vγ4清除组小鼠严重，组织切片HE染色显示野生组表皮增厚较Vγ4清除组明显;
　　3.流式细胞仪检测显示野生组及Vγ4清除组正常小鼠表皮细胞内无Vγ4T细胞，诱导炎症后表皮内出现的Vγ4T细胞约占γδT细胞总量的20％，其中约40％Vγ4T细胞分泌IL-17A;Vγ4清除组诱导炎症后小鼠表皮内无Vγ4T细胞表达，表皮细胞分泌的IL-17A明显减少;
　　4.Western blot检测结果显示野生组小鼠表皮组织蛋白促炎因子IL-23、IL-1β的表达高于Vγ4清除组;利用IL-23、IL-1β中和抗体中和小鼠皮下的IL-23、IL-1β后，咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样皮炎减轻并且表皮内Vγ4T细胞分泌的IL-17A较野生组小鼠减少;
　　5.第二次利用咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎较初发皮炎严重，并且真皮内的Vγ4T细胞在第二次诱导银屑病样皮炎后发生快速分化、增殖;此外，真皮内的Vγ4T细胞分泌的IL-17A、γ-IFN、IL-22在第二次诱导的银屑病样皮炎均增多;
　　6.第二次诱导银屑病样皮炎前清除小鼠体内Vγ4T细胞后，诱导的银屑病样皮炎较野生组第二次诱导的银屑病样皮炎减轻，且清除组真皮细胞内分泌的IL-17A、γ-IFN均减少，而IL-22的分泌增多。
　　结论：
　　总结本次课题的研究结果，得到如下结论:
　　1.通过咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎成功比较了野生组与Vγ4清除组两组小鼠的皮炎变化，其中诱导炎症后Vγ4T细胞出现在表皮内并分泌IL-17，而Vγ4清除组咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎减轻;
　　2.小鼠表皮内表达的IL-23、IL-1β对银屑病样皮炎的发展有促进作用;
　　3.初次外用咪喹莫特诱导银屑病样皮炎后，当再次接触相同刺激时，真皮内的Vγ4T细胞快速分化、增殖并分泌多种促炎细胞因子加重银屑病样皮炎。
　　该项课题通过比较不同模型的小鼠银屑病样皮炎与皮肤内Vγ4T细胞的关系研究，为进一步研究银屑病的发病机制提供了新的参考思路。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 Vγ4+γδ+T细胞在表皮内加重咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎及其机理研究

2．1 研究背景

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 真皮内的Vγ4细胞对眯喹莫特诱导的第二次银屑病样皮炎模型的影响

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 真皮内γδT细胞在银屑病发病机制中的作用研究进展

攻读硕士学位期间发表文章

致谢