东南沿海地区蝙蝠携带病毒的初步调查研究

摘要

蝙蝠是数量仅次于啮齿类动物的翼手目(Chiroptera)类哺乳动物，共包含19个科962种，在全球范围内广泛分布。蝙蝠携带病原种类繁多，其中检测到病毒137种，涉及人畜共患病病毒61种。值得注意的是这其中包括一些对人高致病性的病毒，如SARS样冠状病毒(SARS-like coronavirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒（Marburg virus）、狂犬病毒(Rabies virus)、登革病毒(Dengue virus)等。近期研究结果表明一些新病毒正陆续从蝙蝠体内被发现，包括肝炎病毒(Hepatitis virus)、呼肠孤病毒(Retrovirus)、博卡病毒(Bocavirus)、圆环病毒(Circovirus)、星状病毒(Astrovirus)等均发现一些新的种。2003年的“非典”疫情，共造成全球8，000多人感染，至少800人死亡，使冠状病毒在全球范围内引起关注。2014年西非的埃博拉疫情，导致6，388人丧生，确诊或疑似感染病例17，942个。2016年阿根廷的登革病毒疫情，造成15，000人感染。引发这几次疫情的病原有一个共同的动物宿主——蝙蝠。因此，蝙蝠作为自然界贮存病原的巨大病原库，引起了越来越多科研工作者的关注。
　　病毒宏基因组学是在宏基因组学理论基础上，结合传统病原检测技术新兴的学科分支，其应用迅速展示出巨大的优越性，尤其是在新发病毒的发现和预警方面，突破了传统方法依赖病毒保守基因序列的局限性。本研究基于病毒宏基因组学策略，系统分析2015年7-8月从我国东南沿海部分地区共收集的5种210只蝙蝠。对采集的蝙蝠的肠和肺组织进行高通量测序，对测序结果进行分类整理，发现获得的序列信息共涉及38个病毒科。其中包括16个脊椎动物病毒科、4个植物病毒科、5个昆虫病毒科。感染脊椎动物的病毒包括冠状病毒科（Coronaviridae）、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科（Herpesviridae）、双小RNA病毒科（Picornaviridae）、逆转录病毒科（Retroviridae）、非洲猪瘟样病毒病毒科(Asfarviridae)、星状病毒科（Astroviridae）、杯状病毒科（Caliciviridae）;圆环病毒科（Circoviridae）、肝炎病毒科（Hepeviridae）、乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）、呼肠孤病毒科（Retroviridae）;黄病毒科（Flaviviridae）、痘病毒科（Poxviridae）和披膜病毒科（Togaviridae）。通过序列分析比较发现，不同地区和不同蝙蝠种类在注释到的病毒种类、序列方面存在同源性和丰度差异。初步掌握了东南沿海部分地区蝙蝠携带病毒的生态学状况，为下一步验证工作的开展提供了方向。
　　根据宏基因组注释信息，选取了圆环病毒、博卡病毒、软腐病毒等设计简并引物，应用特异性RT-PCR检测方法，获取了上述病毒在蝙蝠体内和不同地域的携带和分布情况。结果显示在舟山、岱山、长乐、连江蝙蝠体内各检测到1株圆环病毒，分别命名为BtCV-ZS62、BtCV-DS13、BtCV-CL6、BtCV-LJ22;在岱山蝙蝠体内检测到2株博卡病毒，命名为:BtBov-DS9和BtBov-DS10;在厦门蝙蝠体内检测到2株软腐病毒，命名为BtIFA-XM9和BtIFA-XM10。基于宏基因测序注释信息，借助已知同源序列保守区设计系列简并套式引物，经反向PCR扩增、序列测定和拼接，进一步获得了其中4株圆环病毒的全基因序列(1，873bp、1，910bp、2，051bp、1，806bp)和1株博卡病毒的大部分序列(3，921bp)。依据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)关于圆环病毒新种的判定标准，初步判断BtCV-ZS62、BtCV-DS13、BtCV-CL6、BtCV-LJ22是四种新的蝙蝠圆环病毒，属于圆环病毒科，圆环病毒属。根据ICTV关于博卡细小病毒新种的判定标准，初步判断BtBov-DS10是一株全新的博卡细小病毒。
　　在获得上述病毒基因组信息基础上，选取圆环病毒、博卡病毒进行重组结构蛋白制备和血清流行病学初步分析，选择结构蛋白BtB OV-DS10-NP和BtCV-DS13-Cap进行原核表达和纯化，探索从血清学水平初步验证蝙蝠携带病毒情况，以期完善病毒感染的流行病学证据链。
　　我国蝙蝠种类丰富，有7科130种，分布广泛，其生态圈与人类活动圈有较大交叉。因此开展我国蝙蝠携带病毒的自然本底调查对于预防新发传染病具有重要的公共卫生学意义。本研究借助病毒宏基因组生态调查方法，获得东南沿海部分地区蝙蝠病毒宏基因组信息，并基于注释信息进行特异性PCR筛查和序列扩增测定，能快速而准确获得蝙蝠携带病毒谱并发现新病毒。该调查方法大大降低了病毒本底调查的盲目性，结合特定靶病毒蛋白的功能分析等研究，也较好拓宽了病毒生态调查的宽度和深度。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一章 蝙蝠病毒的检测与鉴定

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 蝙蝠博卡病毒BtBOV-DS10-NP蛋白和圆环病毒BtCV-DS13-Cap蛋白生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 蝙蝠博卡病毒BtBOV-DS10-NP蛋白和圆环病毒BtCV-DS13-Cap蛋白原核表达及样本血清检测

3．1 材料

3．2 BtBOV-DS10-NP蛋白原核表达及样本血清检测

3．3 BtCV-DS13-Cap蛋白原核表达及样本血清检测

3．4 BtBOV-DS10-NP蛋白原核表达及样本血清检测结果

3．5 BtCV-DS13-Cap蛋白原核表达及样本血清检测结果

3．6 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 基于序列非依赖性扩增发现未知病毒的研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢