MicroRNA-149在左心疾病相关肺高压形成中的作用及预测价值

摘要

目的：
　　通过建立大鼠主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction，TAC）模型，观察左心负荷增高对肺血流动力学及肺血管重构的影响;利用芯片筛选出TAC大鼠模型肺组织表达变化的microRNA谱，分析其调控的靶基因与信号通路，并在组织和循环水平上进行验证，分析循环microRNA变化与血流动力学的相关性;通过临床病例验证，进一步探索microRNA对PH-LHD的预测意义。
　　方法：
　　第一部分：
　　1.建模：40只健康雄性SD大鼠随机分为Sham组(n=20)和TAC组(n=20)，TAC组在主动脉弓处以16G针头垫扎，形成主动脉弓缩窄;Sham组不结扎主动脉弓。
　　2.检测指标：1）一般情况;2）心脏超声检测大鼠心脏重构和功能;3）心导管检查明确血流动力学变化;4）病理学观察肺血管重构。
　　第二部分：
　　1.利用microRNA芯片检测TAC和Sham大鼠肺组织样本，筛选microRNA的差异表达谱，并使用miR-Path v.3预测经过聚类的两组差异microRNA靶基因，得到靶基因的富集结果，预测PH-LHD相关信号通路。
　　2.采用基于SYBR Green荧光染料的方法对肺组织差异表达的microRNA行实时定量PCR检测验证;进一步检测大鼠血清microRNA水平，并统计分析其与大鼠血流动力学指标的相关性。
　　第三部分：
　　1.根据纳入排除标准选取于2014年6月至2016年11月在第三军医大学第二附属医院心内科就诊患者，以PASP≥50mmHg作为诊断PH的依据，收集PH-LHD患者34例、单纯LHD46例。采集受试者的基本资料与临床数据：年龄、性别、身高、体重、吸烟史、体重指数、血压、心率、纽约心功能分级、心脏超声检测数据、BNP。采用实时定量PCR检测所有受试者血清中microRNA水平，分析其与临床数据的相关性。
　　2.使用SPSS软件（版本20.0，IBM公司，美国）进行统计分析。计量资料用中位数和四分位数间距表示，计数资料用例数和百分比表示;组间资料的差异采用Mann-Whitney U非参数检验进行分析;采用Spearman相关系数评估miR-149水平与临床指标的相关性;采用logistic回归进行单因素、多因素分析，并计算得到比值比、95％可信区间;采用ROC曲线进行预测价值分析，并计算到曲线下面积、敏感度、特异度。
　　结果：
　　第一部分：
　　1.手术过程中因麻醉意外、气胸、主动脉破裂原因导致TAC组3只死亡，Sham组9只死亡;在8周的饲养过程中，观察到与Sham组相比，TAC组模型体重减轻，四肢及胸前区出现青紫，精神状态欠佳，共计7只在饲养过程中死亡;最后得到10只TAC模型，11只Sham模型。进一步称重测量表明，与Sham组相比，TAC组右心肥厚指数(RVHI)升高(23.46±0.77％vs27.40±2.68％;P=0.010)。
　　2.模型建立8周时，心脏超声检查提示，与Sham组(n=11)相比，TAC组(n=10)肺动脉直径增大：2.61(2.50，3.31)mm vs2.97(2.75，3.25)mm(P＜0.05);左室射血分数降低：84.99(79.53，88.46)％vs69.75(56.57，82.61)％(P＜0.05);左室心肌质量增加：573.27(465.68，677.54)mg vs680.77(588.27，836.55)mg(P＜0.05);舒张期左室体积增大：160.40(125.04,187.51)ul vs201.86(162.47,217.21)ul(P＜0.05)。
　　3.模型建立8周时，右心导管检查发现，与Sham组(n=11)相比，TAC组(n=10)mean pulmonary arterial pressure(mPAP)升高(16.22±2.23mmHg vs22.13±2.74mmHg;P＜0.001)，其中90％的模型大鼠mPAP介于19-24mmHg之间，属于临界PH;1只模型大鼠mPAP达到28.64mmHg，形成PH。同时LVSP(140.04±28.01mmHg vs172.22±29.17mmHg;P＜0.001)、RVSP(26.66±2.74mmHg vs29.12±2.08mmHg;P=0.031)升高，LV Max(dp/dt)(12278.66±1309.28m mHg/s vs9124.76±838.36mmHg/s;P＜0.001)、RV Max(dp/dt)(1892.47±272.69mmHg/s vs1491.78±261.20mmHg/s;P=0.003)降低。
　　第二部分：
　　1.以Sham组大鼠肺组织为对照，经microRNA芯片分析，一共对385个microRNA进行检测分析，筛选出TAC组水平差异大于1.5倍且具有统计学意义的microRNA，差异基因经过聚类分析排除个体差异，发现较Sham组，TAC组上调的有rno-miR-143-3p、rno-miR-181a-5p、rno-miR-125b-1-3p，下调的有rno-miR-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-149-3p，进一步KEGG信号通路分析发现差异变化的microRNA靶基因（其中包括Tnf、Chrd、Smad2、Smad7、Acvr1c、Acvr2a、Rps6kb1、Smurf2、Bmp5、Tgfbr1）的功能集中于TGF-β信号通路。
　　2.进一步验证大鼠肺组织miR-149水平，发现TAC组miR-149水平下调，RQ值分别为（1.141±0.201vs0.300±0.028;P＜0.001）。检测TAC大鼠血清miR-149水平，发现变化趋势与肺组织一致，相对定量(RQ)值分别为(1.018±0.060vs0.467±0.047;P＜0.001);统计分析循环miR-149水平与大鼠血流动力学指标相关性分析，循环miR-149水平与mPAP(r=-0.752，P＜0.001)、RVHI(r=-0.643，P=0.002)呈负相关，与LVSP(r=0.739，P＜0.001)、RVMax(dp/dt)(r=0.534,P=0.013)、LVMax(dp/dt)(r=0.728,P＜0.001)呈正相关，与RVSP(r=-0.309，P=0.173)统计学上无相关性。
　　第三部分：
　　1.检测受试者循环miR-149水平，发现LHD对照组以及PH-LHD组RQ值分别为1.00(0.73，1.81)vs0.58(0.49，1.08)，经统计学析PH-LHD组miR-149的表达显著低于LHD组(P=0.002)。采用Spearman相关性分析发现受试者循环miR-149与PASP(r=-0.286，P=0.010)、左心室舒张末期内径（r=-0.345，P=0.002）、BNP(r=-0.306，P=0.006)、纽约心功能分级(r=-0.232，P=0.038)呈负相关;与LVEF呈正相关(r=0.247，P=0.027)。
　　2.通过logistic回归分析发现，循环miR-149降低，PASP≥50mmHg发生的可能性增高。应用ROC曲线评估miR-149对PASP≥50mmHg发生的预测价值：AUC=0.699，95％CI：0.579～0.820(P=0.002)，其最佳阈值为0.52，敏感度为0.500，特异度为0.891。采用二元Logistic正向逐步回归筛选出预测PASP≥50mmHg的联合标志物为左心房舒张末期内径、循环miR-149和BNP并获得其预测模型，ROC分析表明预测模型曲线下面积(AUC)为0.889(95％CI：0.818～0.960，P＜0.001)，阂值为0.41时敏感度为0.882，特异度为0.818，较单独循环miR-149预测价值高。
　　结论：
　　1.主动脉弓缩窄导致左心负荷增高和左心功能降低的同时，引起肺动脉压轻度增高和右心功能损害。
　　2.主动脉弓缩窄导致左心负荷增高和左心功能降低时，肺组织microRNA表达谱发生变化，其中rno-miR-143-3p、rno-miR-181a-5p、mo-miR-125b-1-3p上调，rno-miR-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-149-3p下调，KEGG信号通路分析发现芯片筛选的差异变化microRNA靶基因的功能集中于TGF-β信号通路。
　　3.动物模型中TAC组大鼠肺组织和循环miR-149水平较Sham组显著降低。
　　4.与LHD患者相比，PH-LHD患者循环miR-149水平显著降低，循环miR-149可作为LHD患者合并PH的独立预测因子。联合miR-149、左心房舒张末期内径和BNP预测LHD患者合并PH的敏感性为0.882，特异性为0.818。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 大鼠左心超负荷模型的建立及对肺血管重构和肺高压的影响

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

第三章 大鼠左心超负荷模型肺组织microRNA表达谱的变化

3．1 引言

3．2 研究材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

第四章 左心疾病患者循环microRNA-149水平的变化及其预测肺高压的价值

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 超声心动图在肺高压诊断和预后中的作用

研究生期间发表论文

致谢