补体C3对同种异基因移植排斥中Th17细胞应答的调控机制研究

摘要

移植是治疗器官功能衰竭的有效手段，移植排斥反应是移植物丢失的主要原因。CD4+T细胞是介导移植排斥反应的重要细胞，不同CD4+T细胞亚群在移植排斥反应中功能各不相同。Th1及Th17细胞加速移植排斥，而Th2及Treg细胞则诱导移植物耐受。目前广泛使用的免疫抑制药物，如环孢素A、FK506及雷帕霉素等，通过抑制整个T细胞亚群的增殖分化来调控移植排斥反应，存在明显的局限性。因此，发展选择性抑制T细胞亚群的新型免疫抑制剂是未来抗排斥药物研究的方向。研究移植状态下T细胞亚群分化调节机制，对于理解移植排斥反应病理生理和发展选择性干预T细胞的抗排斥反应药物具有十分重要的意义。
　　Th17是CD4+T细胞的重要亚群，因主要分泌细胞因子IL-17得名。IL-17可向炎症部位募集大量单核细胞、中性粒细胞或与其它炎症因子共同作用参与调节免疫炎症反应。Th17细胞在过敏性哮喘、糖尿病、银屑病、SLE及移植排斥反应中具有重要作用。研究发现，Th17细胞局部浸润与移植肾功能及肾组织损伤的严重程度显著相关。运用特异性抗体阻断IL-17A，小鼠移植肺中淋巴细胞及IFN-γ阳性细胞浸润显著降低，且阻塞性支气管炎显著缓解。研究移植状态下Th17细胞分化调控机制，对开发特异性调节药物具有重要的价值。
　　补体是天然免疫系统的重要组分。研究表明，补体参与调节T细胞增殖分化。CD4+T细胞上表达补体受体C3aR及C5aR，与补体活化产物C3a及C5a结合后，激活G蛋白下游通路，促进T细胞增殖分化及Th1细胞应答。同种异基因小鼠肾移植中补体C5aR基因缺陷显著延长移植物存活，T细胞应答明显减弱，表明同种异基因移植排斥反应中补体参与调节T细胞增殖分化。然而，同种异基因移植中补体活化是否与Th17细胞存在关联并参与调节Th17细胞增殖分化尚不清楚。补体C3是补体系统的枢纽分子。补体C3基因缺陷时，Th1/Th17细胞应答衰减，同时补体C3参与调节Treg细胞增殖分化及功能发挥，提示同种异基因移植中补体C3可能参与调节Treg/Th17细胞应答，在移植排斥反应中发挥重要作用。
　　目的：
　　1、研究同种异基因移植过程中补体的活化及Th17细胞增殖分化的关联;
　　2、建立同种异基因移植模型，明确补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响;
　　3、深入探讨补体C3对同种异基因移植排斥反应中Th17细胞应答的调控机制。
　　方法：
　　1、同种异基因移植中补体的活化及Th17细胞的增殖分化
　　1)收集肾移植患者外周血，分离PBMC及血清，FCM检测移植排斥过程中Th17细胞增殖分化，ELISA检测补体活化片段C3a及C5a含量，明确移植过程中补体活化情况;
　　2)收集发生急慢性排斥反应及正常肾组织，IHC检测肾组织中补体活化、IL-17表达、T细胞浸润，免疫荧光染色IF检测排斥肾组织中Th17细胞浸润情况。
　　3)培养人近端肾小管上皮细胞(HK2)，以补体活化产物C3a刺激后，IHC检测HK2中IL-17的分泌。
　　4)补体活化产物C5a刺激HK2后，IHC及FCM检测HK2中IL-17的分泌。
　　2、同种异基因移植中补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响
　　1) Bm12，C3+/+及C3-/-小鼠尾部皮肤分别移植到Bm12小鼠背部，7天后观察移植物排斥反应，明确局部补体C3缺乏对同种异基因移植物存活的影响;
　　2) Bm12小鼠尾部皮肤分别移植到C3+/+或者C3-/-小鼠背部，7天后观察移植物排斥反应，明确系统性补体C3缺乏对同种异基因移植物存活的影响。
　　3)通过HE、IHC及IF染色检测移植物局部中性粒细胞、巨噬细胞、Th17细胞及DC等浸润情况，qPCR检测移植物局部炎症因子及趋化因子表达情况。
　　4)移植不同时间点，取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结及脾脏，FCM检测Th1/17细胞频率，明确补体C3缺陷对Th1/17细胞应答的影响。
　　3、同种异基因移植中补体组分C3对Th17细胞应答的调节机制
　　1)移植10天后，取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结，MLR检测补体C3缺陷对淋巴细胞增殖的影响。
　　2)移植不同时间点，取Bm12小鼠腋窝引流淋巴结及脾脏，FCM检测Treg细胞频率，明确在此模型中补体C3缺陷对Treg细胞应答的影响。
　　3)利用Anti-CD25 mAb去除Treg细胞后，观察C3-/-移植物存活情况，深入探讨Treg细胞在延长C3-/-移植物存活中的重要作用。
　　4)分离纯化Na(i)ve CD4+T细胞与辐照后的BMDCs共培养9-12天，收集上清检测IL-10的分泌，收集细胞通过PCR及FCM检测Treg细胞增殖分化情况。
　　结果：
　　1、同种异基因移植中，补体大量活化及Th17细胞应答增强
　　1)与移植前相比，同种异基因肾移植后患者血清中补体活化片段C3a及C5a浓度显著增加;发生排斥反应肾组织中补体C3、补体受体C5aR及补体活化终产物C5b-9较正常肾组织表达明显增加。
　　2)与移植前相比，同种异基因肾移植后患者PBMCs中Th17细胞频率升高;排斥反应肾组织中Th17细胞浸润显著增加。
　　3)与未刺激组相比，补体活化产物C3a及C5a刺激显著上调IL-17表达。
　　2、局部补体组分C3缺陷显著延长同种异基因移植物存活时间并衰减Th17细胞应答
　　1)来源于C3+/+移植物在移植后17天被完全排斥，与之不同的是，来源于C3-/-移植物存活时间显著延长，60％ C3-/-B6移植物存活时间超过30天，表明移植物局部C3基因缺陷可延长MHC-Ⅱ不匹配同种异基因移植物存活时间。
　　2)Bm12移植物存活时间在C3+/+及C3-/-两种小鼠间没有差异，移植物存活时间均小于14天，表明系统性C3缺陷不能延长同种异基因移植物存活时间。
　　3)HE染色发现，C3-/-移植物组织坏死、单核细胞浸润显著减轻;IHC检测发现，C3-/-移植物中性粒细胞、巨噬细胞及T细胞浸润显著减少;IF检测发现，C3-/-移植物局部Th17细胞浸润明显减少。
　　4)qPCR检测发现，C3-/-移植物中Th1/Th17细胞应答关键炎症因子，如细胞因子IFN-γ、IL-17及IL-23，趋化因子CXCL-9，mRNA表达显著降低。与之相似的是炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α在C3-/-移植物表达亦显著衰减。表明，移植物局部补体C3缺乏导致Th1/Th17细胞应答相关炎症因子及趋化因子表达降低。
　　5)FCM检测发现，C3-/-移植物显著降低Th1/17细胞频率，表明同种异基因移植中补体C3促进Th1/17细胞应答。
　　3、同种异基因移植排斥中，补体组分C3抑制Treg细胞增殖分化，促进Th17细胞应答，加速排斥反应发生
　　1)MLR实验发现，补体C3基因缺陷时淋巴细胞增殖显著降低。
　　2)PCR及IHC检测移植物中Treg细胞特异性转录因子Foxp3表达，发现C3-/-移植物中Foxp3表达显著上升，表明C3-/-移植物存活延长可能与Treg的密切相关。
　　3)FCM检测Bm12小鼠脾脏及引流淋巴结中Treg细胞频率，发现，C3-/-移植物显著增加Treg细胞频率，表明C3-/-移植物存活延长可能依赖于Treg细胞的扩增。
　　4)Anti-CD25 mAb去除Treg细胞后观测C3-/-移植物存活，发现，去除Treg细胞后Th17细胞应答增强，C3-/-移植物存活时间显著缩短，排斥反应明显增强，表明Treg在促进C3-/-移植物存活延长中发挥关键作用。
　　5)IF检测发现，C3-/-移植物中DCs浸润明显减少，共刺激分子CD80表达减弱;通过将BMDCs与Na(i)ve CD4+T细胞共培养，发现，与C3+/+DCs相比，C3-/-DCs能够显著促进IL-10的分泌，Foxp3表达及Tregs增殖分化，表明补体C3通过DCs抑制Tregs细胞增殖分化。
　　结论：
　　本研究中，我们通过收集临床同种异基因肾移植标本，检测补体活化及Th17细胞增殖分化;通过体外细胞实验，检测补体活化产物对IL-17产生的影响;建立同种异基因移植模型，明确补体组分C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响;深入探讨补体C3在同种异基因移植排斥中对Th17细胞应答的调控机制，得出主要结论如下:
　　1、同种异基因移植过程中，补体的大量活化与Th17细胞应答紧密相关;
　　2、同种异基因移植中，补体C3缺陷显著延长移植物的存活时间并衰减Th17细胞应答;
　　3、同种异基因移植排斥反应中，补体组分C3抑制Tregs细胞增殖分化，促进Th17细胞应答，加速排斥反应发生。

目录

声明

缩略英文缩写

摘要

第一章 前言

1．1 研究意义

1．2 研究背景

1．3 本文拟开展的研究工作

第二章 同种异基因移植中补体的活化及Th17细胞的增殖分化

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 同种异基因移植中补体C3对移植物存活及Th17细胞应答的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 补体C3对同种异基因移植排斥反应中Th17细胞应答的调控机制

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

研究生期间参与的其它工作

文献综述 补体与肾移植排斥反应

攻读学位期间研究成果

致谢