微波辅助-双水相萃取山豆根中有效成分的研究

摘要

山豆根（Sophorae tonkinesisRadix.），又称为广豆根、苦豆根、山大豆根，是豆科槐属植物越南槐（Sophora tonkinensis Gapnep.）的干燥根及根茎，具有清热解毒、消肿止痛的功效。现代研究表明，山豆根萃取物不但具有消炎、抗菌、抗肿瘤的活性，还能调节免疫系统。山豆根的主要活性成分主要是生物碱类和多糖类，对此类活性成分的分离手段主要是加热回流和索氏萃取，然而这种传统的萃取分离方式的所消耗药材和有机试剂的量极大，萃取效率低，对环境和实验人员同样存在影响。微波辅助萃取以强极性的溶剂作为介质，利用微波的热效应与非热效应等特征，可迅速提升温度，使加热在介质的外部与内部同时进行，缩短了加热过程中热传导的时间，提升了的加热效率，对被萃取样品中的目标成分进行快速高效的选择性萃取的过程。双水相体系是指高聚物、无机盐、有机试剂等与水混合后，会形成稳定透明、互不相容的两相。双水相体系能够根据被萃取物的性质进行组成成分和比例的调整，在达到最优的萃取效率的同时确保其活性。本文中采用微波辅助-双水相萃取技术对山豆根中的活性成分进行选择性的萃取分离，考察了不同种类的无机盐对双水相组成的影响，绘制相图拟合数据并与相平衡数据进行关联，然后从中筛选出萃取山豆根活性成分最优的体系，对其萃取条件进行优化，再利用所建立的HPLC分析方法对活性成分进行分析和定量，研究的主要内容如下：
　　1、在20、40、60、80℃四个温度的条件下，绘制乙醇与磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸钠的相图，运用 Merchuk经验方程分别对双节线数据进行拟合；重量法测定双水相液-液相平衡数据，利用MATLAB进行计算同时应用Othmer-Tobias和Bancroft经验方程计算其关联度，验证数据的准确性。利用拟合公式计算双水乡的组成，以山豆根生物碱和多糖的萃取率为标准，筛选出合适的双水相萃取体系。
　　2、建立HPLC分析方法分析山豆根中的生物碱成分，以及山豆根多糖中的单糖组成。以乙腈-甲醇-0.1％氨水为流动相，220nm的检测波长，30℃的柱温，检测山豆根生物碱中的成分。5种生物碱标准品在0.002~0.2 mg/mL范围内的呈线性，其加标回收率在97.14~102.7%之间。检测结果显示，山豆根中主要含有的是苦参碱、氧化苦参碱，以及少量槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱等喹诺里西啶类生物碱；以乙腈-50 mmol/L磷酸缓冲盐为流动相，245 nm的检测波长，柱温为30℃的条件下检测的多糖水解后单糖的衍生物，10种单糖标准品在0.001~0.5 mg/mL范围内的呈线性，其加标回收率在97.19~102.7%之间。检测结果显示，山豆根多糖主要是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖7种组成。
　　3、以乙醇-磷酸氢二钠双水相体系作为萃取溶剂，微波辅助萃取山豆根中的生物碱，利用酸性染料比色法测定生物碱的含量，探讨了微波辅助-双水相技术对萃取山豆根生物碱的影响，通过单因素试验选择了4个显著影响生物碱萃取率的因素，中心组合-响应面优化萃取条件，所得到的最优萃取条件为：双水相的相比2.43，液料比74.36：1，颗粒度为89.31目，萃取温度为88.29℃，山豆根生物碱预测的萃取率为29.13 mg/g。按照最优组合设计实验，最终得到的生物碱萃取率为29.41 mg/g，与预测值相近，说明响应面优化设计所做出的预测模型可以用于山豆根生物碱萃取条件的优化。利用乙醇-磷酸氢二钠双水相体系可以将山豆根中的生物碱类成分富集至上相中，一步即可完成萃取富集纯化等过程，然后用所建立的HPLC分析方法对山豆根生物碱中的组分进行定性定量的测定，测得的山豆根中生物碱以苦参碱、氧化苦参碱为主，同时还含有少量的槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱。
　　4、乙醇-磷酸氢二钠双水相体系作为萃取溶剂，微波辅助萃取山豆根中的多糖类成分，利用硫酸-苯酚显色法测定上下相中多糖的含量。探讨了微波辅助-双水相技术对萃取山豆根多糖的影响，通过单因素试验选择了4个显著影响山豆根多糖萃取率的因素，中心组合-响应面优化萃取条件，其最优萃取条件为：无机盐百分比为42.14%，乙醇的百分比为15.48%，萃取温度为91.53℃，萃取时间为6.44 min，预测得到山豆根多糖的质量为108.74 mg/g。按照最优组合设计实验最终得到的多糖质量为109.3 mg/g，与预测值相近，说明响应面优化设计所做出的预测模型可以用于山豆根生物碱萃取条件的优化。分别采用红外光谱和凝胶色谱以及所建立HPLC单糖组分检测方法，对萃取分配至双水相上下相中山豆根多糖的结构、分子量和单糖构成进行分析，并探讨双水相中多糖分配的机理。

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第一章 文献综述

1.1山豆根概述

1.2 山豆根的研究进展

1.3 微波辅助萃取的研究进展

1.4双水相萃取技术的研究进展

1.5 本课题的主要研究内容和意义

参考文献

第二章 山豆根中有效成分的测定

2.1 前言

2.2 仪器与试剂

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5样品分析

2.6 本章小结

参考文献

第三章 乙醇-磷酸盐双水相体系相图的绘制与拟合以及实际应用

3.1 前言

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

参考文献

第四章 响应面法优化-微波辅助双水相萃取山豆根生物碱

4.1前言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

参考文献

第五章 响应面法优化-微波辅助双水相萃取山豆根多糖

5.1 前言

5.2 仪器与试剂

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

参考文献

附录 攻读学位期间发表的论文

致谢