基于破骨细胞功能探讨腺苷激酶敲除小鼠和贞术调脂胶囊对骨代谢的影响

摘要

目的：我们在构建髓性单核细胞敲除腺苷激酶（Adenosine Kinase，ADK）的小鼠过程中，与对照组小鼠相比，显示体重明显下降。因此，我们将利用髓性单核细胞系特异性敲除ADK小鼠进行破骨细胞(osteoclast，OC)分化和骨吸收功能的研究，探讨髓性单核细胞敲除ADK对骨代谢的影响。同时在建立的破骨细胞体外培养体系下，评价贞术调脂胶囊（FTZ）对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响。
　　方法：
　　1.髓性单核细胞敲除ADK小鼠的鉴定方法
　　选取杂交繁殖后的子代鼠尾进行PCR基因型分析鉴定，筛选出ADKf/f、ADKf/flysmcre/cre、ADKf/flysmcre/+三种基因敲除小鼠。采用Western-blot技术检测不同基因型小鼠原代巨噬细胞ADK蛋白的表达量。
　　2.体外破骨细胞分化及骨吸收功能检测方法
　　利用ADKf/f、ADKf/flysmcre/cre、ADKf/flysmcre/+三种基因敲除小鼠，体外获取分离小鼠的原代骨髓单核细胞，在M-CSF和RANKL的刺激下诱导培养破骨细胞，同时收集野生型BL/6J小鼠原代骨髓单核细胞并给予ADK抑制剂（ABT-702）干预，进行抗酒石酸酸性磷酸酶特异性Trap染色、骨吸收实验、骨代谢功能相关TRAP、NFATc1、c-Fos、MMP-9、CtsK、c-Src、CTR基因RT-PCR检测，评价髓性单核细胞敲除ADK对体外破骨细胞分化及骨吸收功能的作用。
　　3.基因型小鼠骨形态计量学检测方法
　　比较4月龄ADKf/f、ADKf/flysmcre/cre、ADKf/flysmcre/+雄性小鼠的体重、股骨湿重；收集胫骨上、中段组织，采用HE染色观察小鼠骨组织病理形态学改变，通过骨组织静态学分析系统分析小鼠体内骨量的变化。
　　4.FTZ对体外破骨细胞分化和骨吸收的影响
　　利用已建立的破骨细胞体外培养体系，收集野生型BL/6J小鼠原代骨髓单核细胞，并添加大鼠含药血清干预，进行抗酒石酸酸性磷酸酶特异性TRAP染色、骨吸收实验、骨代谢功能相关TRAP、NFATc1、c-Fos、MMP-9、CtsK、c-Src、CTR基因RT-PCR检测，评价FTZ对破骨细胞分化和吸收功能的作用。
　　结果：
　　1.ADKf/flysmcre/cre小鼠ADK的敲除效率比ADKf/fLysmcre/+小鼠、ADKf/f小鼠高。
　　（1）PCR检测鼠尾基因型鉴定结果：ADK纯合子条带为360bp；ADKf/f小鼠在350bp处有1条清晰条带，ADKf/flysmcre/cre小鼠在700bp处有一条清晰条带，ADKf/flysmcre/+小鼠在350bp、700bp处有两条条带。
　　（2）Western blot检测髓性单核细胞ADK蛋白水平结果：与ADKf/f组相比较，ADKf/fLysmcre/cre组ADK蛋白表达水平降低69.77％（P＜0.01），ADKf/fLysmcre/+组ADK蛋白表达水平降低36.83%（P＞0.05）。
　　2.髓性单核细胞敲除ADK小鼠体外破骨细胞分化增多，骨吸收功能增强。
　　（1）髓性单核细胞敲除ADK小鼠增加了破骨细胞分化：不同基因型小鼠体外破骨细胞培养结果发现，与ADKf/f组相比，ADKf/fLysmcre/cre组的破骨细胞数量较多，具有显著性差异（P＜0.01）；但ADKf/fLysmcre/+组的破骨细胞数量无明显变化（P＞0.05）；与ADKf/fLysmcre/cre组相比，ADKf/fLysmcre/+组的破骨细胞数量有显著性差异（P＜0.01）。ABT-702干预破骨细胞培养结果发现，分别与control组、5%EtOH组相比，100nM组的破骨细胞数量较多，有显著性差异（P＜0.01）。
　　破骨细胞分化相关基因RT-PCR检测结果，相比于ADKf/f组，ADKf/fLysmcre/cre组的TRAP（P＜0.01）、NFATc1（P＜0.05）基因表达量增加；c-Fos基因表达量无差异（P＞0.05），但ADKf/fLysmcre/+组上述基因无明显变化（P＞0.05）；与ADKf/fLysmcre/cre组相比，ADKf/fLysmcre/+组的TRAP和NFATc1基因表达量有统计学差异（P＜0.05），c-Fos基因表达量无差异（P＞0.05）。ABT-702干预破骨细胞分化相关基因RT-PCR结果显示，相比于5%EtOH组，100nM组的TRAP、NFATc1的mRNA基因表达量增多，具有统计学差异（P＜0.05）；c-Fos基因表达量无显著性差异（P＞0.05）。
　　（2）髓性单核细胞敲除ADK增强了破骨细胞吸收功能：不同基因型小鼠体外破骨细胞骨吸收实验结果发现，与ADKf/f组相比，ADKf/fLysmcre/cre组培养的破骨细胞的骨陷窝面积显著增大（P＜0.01）和数量增多（P＜0.05），ADKf/fLysmcre/+组的破骨细胞骨陷窝面积和数量比较，无明显变化（P＞0.05）；与ADKf/fLysmcre/cre组相比，ADKf/fLysmcre/+组的破骨细胞骨陷窝面积和数量均具有显著性差异（P＜0.01）。ABT-702干预破骨细胞骨吸收实验结果发现，与5%EtOH组相比，100nM骨陷窝面积增大和数量增多，有显著性差异（P＜0.01）。
　　破骨细胞吸收功能相关基因RT-PCR检测结果，相比于ADKf/f组，ADKf/fLysmcre/cre组的MMP-9、CtsK、CTR基因表达量增多，具有显著性差异（P＜0.01）,c-Src基因表达量无显著性差异（P＞0.05），ADKf/fLysmcre/+组的CtsK基因表达量有统计学差异（P＜0.05）；与ADKf/fLysmcre/cre组相比，ADKf/fLysmcre/+组的MMP-9、CtsK、CTR基因表达量具有统计学差异（P＜0.05）。ABT-702干预破骨细胞骨吸收相关基因结果显示，相比于5%EtOH组，100nM组的MMP-9（P＜0.01）、CtsK（P＜0.05）基因表达量增多，但c-Src、CTR基因表达量无明显变化（P＞0.05）。
　　3.髓性单核细胞敲除ADK小鼠体内骨量的变化
　　相比于ADKf/f小鼠，ADKf/flysmcre/cre小鼠体重和股骨湿重最轻，具有显著性差异（P＜0.01），ADKf/flysmcre/+小鼠无明显变化（P＞0.05）；与ADKf/fLysmcre/cre小鼠相比，ADKf/fLysmcre/+小鼠体重和股骨重量均有显著性差异（P＜0.01）。ADKf/f组松质骨部分骨小梁丰富呈浅紫粉红色，结构致密粗实，连续性好呈网状，ADKf/fLysmcre/cre组骨小梁明显减少，排列稀疏，断裂状，ADKf/fLysmcre/+组骨小梁结构介于两组间，骨小梁细长，部分断裂。骨组织静态参数结果显示，ADKf/flysmcre/cre小鼠分别与ADKf/f小鼠、ADKf/flysmcre/+小鼠相比，%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、%Ob.S/BS、Ob.N/BS、Tb.Sp、%Oc.S/BS、Oc.N/BS均有统计学差异（P＜0.01；P＜0.05）。同样，胫骨中段分析，ADKf/fLysmcre/cre组与其余两组计较，%Ct.Ar、%Ma.Ar参数变化明显（P＜0.01）。
　　4. FTZ抑制了破骨细胞分化和吸收功能
　　不同浓度剂量对破骨细胞有不一样的抑制作用，与control组相比，Alendronate组、FTZ-H组和FTZ-M组的破骨细胞数量（P＜0.01）、骨陷窝面积（P＜0.05）和骨陷窝数量均减少（P＜0.01），比FTZ-L组的破骨细胞数量少（P＜0.05）和骨陷窝数量少（FTZ-H组P＜0.01；FTZ-M组P＜0.05）；与Alendronate组相比，FTZ-L组的骨陷窝数量具有显著性差异（P＜0.01）。破骨细胞分化相关基因RT-PCR结果显示，相比于control组，FTZ-H组的TRAP、NFATc1基因表达量明显降低（P＜0.05），c-Fos基因表达量无统计学意义（P＞0.05）。骨吸收相关基因表达检测结果显示，与control组相比，FTZ-H组MMP-9基因表达量下降，具有统计学差异（P＜0.01），CtsK、c-Src、CTR基因表达量无明显变化（P＞0.05）。
　　结论：
　　1、髓性单核细胞敲除ADK小鼠增强了破骨细胞分化功能。
　　2、髓性单核细胞敲除ADK小鼠增强了破骨细胞吸收功能。
　　3、髓性单核细胞细胞敲除ADK小鼠显示骨量下降，骨结构异常。
　　4、FTZ改善骨质疏松通过抑制破骨细胞的分化和吸收功能。

目录

声明

1.序言

1.1研究背景

1.2 研究意义

1.3 研究目的

1.4 研究内容

2. 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3. 实验结果

3.1 髓性单核细胞敲除ADK对体外破骨细胞分化及骨吸收功能的影响

3.2 不同基因型小鼠骨形态计量学变化结果

3.3 FTZ对体外破骨细胞分化和骨吸收的影响

4 讨论

4.1 髓性单核细胞敲除ADK小鼠增强破骨细胞分化功能

4.2 髓性单核细胞细胞敲除ADK小鼠增强破骨细胞吸收功能

4.3 髓性单核细胞细胞敲除ADK小鼠显示骨量减少，骨结构异常

4.4 FTZ改善骨质疏松通过抑制破骨细胞的分化和吸收功能

5 小结与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附录：缩写词中英文对照表

致谢