自噬在血管内皮细胞衰老中的作用及17β-雌二醇对其p53通路的干预研究

摘要

背景与目的：人口老龄化是全世界面临的共同难题，在我国尤为严峻。衰老带来的衰老相关疾病发病率增高是社会医疗资源紧缺，社会负担过重的罪魁祸首。血管衰老是机体衰老的一大特征，而血管内皮细胞（Vascular endothelial cell,VEC）衰老是血管衰老的关键环节与始动因素，也是决定动脉粥样硬化、脑卒中、帕金森等众多衰老相关疾病转归与预后的关键因子。
　　雌激素（Estrogen）是众所周知的心血管保护因子，17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）是其主要活性成分，也是较为明确的可延缓VEC衰老的药物之一，但目前对其具体作用机制所知甚少。自噬（Autophagy）是细胞“自我消化”现象，饥饿、氧化应激、缺氧均可改变细胞自噬活性。p53是一种肿瘤抑制蛋白，与DNA损伤后修复、细胞周期调控、凋亡、自噬密切相关，也是众多通路信号中转站，影响着多个通路正常工作。有研究表明，位于细胞核的p53可通过多种方式激活自噬，而17β-E2可通过受体作用增加核内p53的表达，再结合我们前期研究发现17β-E2可延缓VEC衰老，于是我们猜想17β-E2可能通过p53通路上调自噬发挥延缓衰老作用，但国内外仍缺乏相关系统研究。为此，我们将结合p53通路，研究自噬在VEC衰老中的作用及17β-E2的干预机制。
　　方法：
　　第一部分、研究VEC衰老与自噬的关系
　　共设4个组：空白组、过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）组、雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）+H2O2组和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）+H2O2组。从细胞活力、衰老染色、内皮素-1（Endothelin,ET-1）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）、亚细胞结构改变和磷酸化成视网膜瘤蛋白（p-Rb蛋白）表达情况检测细胞衰老程度，再检测各组细胞微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain3,LC3）、Beclin-1和p62表达检测细胞自噬活性；通过对比H2O2组与自噬阳性对照、阴性对照差异，分析VEC衰老与自噬关系。
　　第二部分、研究17β-E2对VEC衰老及自噬活性的影响
　　共设4个组：空白组、H2O2组、17β-E2组和17β-E2+H2O2组。从细胞活力、细胞周期、衰老染色、ET-1、NO和p-Rb蛋白表达情况检测细胞衰老程度，再检测各组细胞LC3-II、Beclin-1、p6和免疫荧光检测自噬小体来分析17β-E2延缓衰老作用和自噬的关系。
　　第三部分、研究17β-E2对p53信号通路的影响
　　共设3个组：空白组、17β-E2组、17β-E2+H2O2组。通过检测p53通路下游通路蛋白p-p53、PUMA、MDM2表达水平分析17β-E2对p53通路的作用。
　　结果：
　　1.适当上调自噬可延缓H2O2诱导的VEC衰老
　　Rapa+H2O2组LC3-II、Beclin-1蛋白表达增多，p62减少，自噬小体数量增加，与H2O2组相比较细胞活力升高，SA-β半糖苷酶阳染率降低，p-Rb表达减少，内皮细胞结构和ET-1、NO相对正常；而予以自噬抑制剂3-MA则得出相反结论，细胞微观结构和功能指标提示其比H2O2组衰老更为明显。
　　2.17β-E2可通过上调自噬延缓H2O2诱导的VEC衰老
　　与H2O2组相比，17β-E2+H2O2组LC3-II、Beclin-1表达增多，p62表达减少，自噬小体荧光数量增多，自噬活性增高，细胞活力增加SA-β半糖苷酶阳染率降低，S期细胞明显增加，NO浓度增加，ET-1减少，p-Rb蛋白表达减少；即17β-E2可延缓VEC衰老，同时增强自噬活性。
　　3.17β-E2具有激活p53通路的作用
　　与空白组相比，17β-E2+H2O2组p53、p-p53和PUMA表达明显增加，MDM2表达减少；除去H2O2影响，17β-E2组p53通路蛋白也明显增加，负性调节蛋白MDM2明显减少。即17β-E2可激活H2O2诱导VEC的p53通路。
　　结论：200mmol/L的H2O2作用24小时可成功诱导出HUVEC衰老模型；适当地上调自噬具有一定延缓VEC衰老的作用；17β-E2可能通过上调自噬延缓H2O2诱导的VEC衰老，该作用可能与激活p53信号通路有关。

目录

声明

序言

1. 研究背景

2. 研究思路

3.技术路线图

第一部分：血管内皮细胞衰老与自噬关系的研究

1. 前言

2. 材料与方法

3.实验方法

4.结果

5. 结论

6. 讨论

1. 前言

2.材料与方法

3. 实验方法

4. 结果

5. 结论

6. 讨论

第三部分：研究17β-E2对p53信号通路的作用

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验方法

4. 结果

5. 结论

6. 讨论

全文结论

本研究不足之处

参考文献

综述:自噬与心血管疾病

攻读学位期间发表论文

附录

致谢