还原响应两亲性壳聚糖的制备及其作为纳米载体性能考察

摘要

随着生物材料及纳米技术的发展，纳米药物递送系统的研究和应用逐渐深入。基于聚合物纳米粒（Polymeric nanoparticles,PNPs)稳定性好、增强药物吸收、鞭向病变部位等优势，越来越多的研究者致力于利用纳米药物载体传递抗癌药物至病变部位。然而，对于一些需要在特定部位或是某一具体细胞器中才能发挥疗效的药物来说，载药纳米粒如何在到达靶部位后快速、有效、完全地释放药物是目前面临的难题之一。本研究设计一种新型药物递送系统，利用肿瘤组织与正常细胞间还原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)浓度的差异性优势，构建了两亲性、还原敏感型聚合物，为抗癌药物的递送提供合理、适宜的纳米载体材料。
　　本文选择具有优良生物降解性和生物相容性的羧甲基壳聚糖（Carboxymethy1 chitosan,CMCTS)为亲水链，脂肪醇（R-OH)为疏水链，含有二硫键的3，3'-二硫代二丙酸（3，3'-Dithiodipropionic acid,DTDP)为连接臂材料合成聚合物。首先DTDP与R-OH通过酯化反应生成中间体R-ss-COOH，粗产物经柱色谱分离纯化；之后中间体一端的羧基再与CMCTS上2位的氨基发生酰化反应生成具有还原敏感性的两亲性聚合物纳米载体材料CMCTS-ss-R。选择不同脂肪醇（十四醇、十六醇、十八醇），以及不同的结构单元CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比（nCMCTS: nR_ss_C00H=1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4),合成一系列含有不同脂肪链、不同脂肪链取代度的聚合物CMCTS-ss-R(CMCTS-ss-C14、CMCTS-ss-C16、CMCTS-ss-C18)。应用FTIR、xHNMR. MS对中间体和终产物进行结构表征，确证成功合成聚合物CMCTS-ss-R。通过茚三酮显色法测定了聚合物中不同脂肪链的取代度，其中，结构单元CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比为1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4制得的聚合物CMCTS-ss-R的取代度为: CMCTS_ss_C14分别为1.57％、2.10%.1.99%,3.04%, CMCTS-ss-C16分别为1.10%、2.04%.3.09%.3.61%, CMCTS-ss-C18分另IJ为1.20%、2.30%、3.19%、4.56%。考察了聚合物在水、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS)以及常用有机溶剂中的溶解性能，其中，CMCTS-ss-R在H20和 PBS(pH7.4)中溶解性较好，而在DMSO、CHC13、CH2C12、CH3OH中不溶。
　　聚合物CMCTS-ss-R在水溶液中自组装形成大小均一的纳米粒，平均粒径在200～300nm；不同疏水链长度及取代度的聚合物纳米粒的Zeta电位分别为：CMCTS-ss-Ci4-15.73-16.95mV、CMCTS-ss-C16-19.03～-20.91mV. CMCTS-ss-C18-20.53-23.69mVo以芘为探针，采用稳态荧光探针法测定了聚合物CMCTS-ss-R的临界聚集浓度（critical aggregation concentration，CAC)^不同的结构单兀CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比(ncMCTS:nR_ss_C00H=1:0.1、1:0.2.1:0.3、1:0.4)制得的聚合物CMCTS-ss-R的CAC为：CMCTS-ss-C14的CAC依次为89.13pg/mL、70.71pg/mL、73.98jig/mL、64.58jig/mL,CMCTS-ss-C16的CAC依次为61_52pg/mL、53.75[ig/mL,47.27jug/mL、33.74飓/mL，CMCTS-ss-C18的CAC依次为61.24pg/mL、47.48jig/mL、40.42pg/mL、27.89pg/mU随着结构单元CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比的减少，聚合物的CAC值越低；同一摩尔投料比的聚合物，随着脂肪链长度的增加，CAC值越低。通过谷胱甘肽（Glutathione，GSH)模拟不同条件还原环境，考察了一系列聚合物CMCTS-ss-R纳米粒的还原敏感性。结果表明，纳米粒在一定浓度GSH刺激下结构迅速瓦解，有着较好的还原响应性。
　　通过溶血实验对聚合物纳米粒的血液相容性进行了考察。对于同一浓度的聚合物纳米粒，随着结构单元CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比的减少，血液相容性逐渐变差，即溶血率H R%值增大；当摩尔投料比相同时，随着疏水链长度的增长，HR%值逐渐减小。虽然CMCTS-ss-R纳米粒的血液相容性较狻甲基壳聚糖CMCTS略差，但CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比为1:0.1的CMCTS-ss-C14纳米粒以及摩尔投料比为1:0.1，1:0.2,1:0.3的CMCTS-ss-C16m米粒、CMCTS-ss-C18m米粒的HR值均低于5%。表明这些聚合物纳米粒有着良好的血液相容性。通过MTT法考察了一系列聚合物纳米粒对L929细胞的安全性以及对A549细胞毒性。实验结果表明，聚合物CMCTS-ss-R纳米粒浓度较低时，对L929细胞的存活率无明显影响；随着纳米粒浓度增加或是CMCTS/R-ss-COOH摩尔投料比减少，细胞毒性增加，IC5。值减少；随着疏水链长度增加，细胞毒性减小，IC5Q值增加。纳米粒对A549细胞的毒性规律与L929细胞相似，相比L929，其IC5()值偏低，但IC5()值均较大，说明聚合物纳米粒的安全性较好，且对A549细胞有一定抑制作用。结合溶血实验、MTT法的数据表明，聚合物CMCTS-ss-R是一种安全性良好的纳米载体材料。

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