TREM2调节的小胶质细胞增殖与活化对AD病理的影响及作用机制

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)，是一种进行性神经退行性疾病，其特征为细胞外淀粉样蛋白沉积和细胞内神经原纤维缠结。其临床症状主要表现为认知功能障碍和记忆减退，并伴有一系列精神和行为改变。AD发生的病因迄今不明，Aβ学说被公认为是AD发生的重要机制。该学说认为，由于代谢异常，导致脑内相关酶活性失调，产生有毒性作用的蛋白片段。该片段不能被及时清除，使其在脑内特定区域堆积，形成β淀粉样沉淀，进一步发展为老年斑，最终引起神经元凋亡，诱发阿尔茨海默病。β淀粉样蛋白（Aβ）是由39-43个氨基酸组成的构成老年斑的主要成分。Aβ40和Aβ42片段是淀粉样蛋白前体（APP）经蛋白水解酶水解后产生的最常见的β淀粉样蛋白片段，其中Aβ42片段含量较少，但是其更容易聚集形成淀粉样蛋白沉积，因此具有更强的毒性。
　　小胶质细胞是脑内常驻免疫细胞，是中枢神经系统(CNS)免疫防线重要的构成细胞，在各种神经系统疾病以及炎症反应中具有极其重要的作用。生理状态下，活化的小胶质细胞在维持中枢神经系统正常功能中发挥重要的作用。II型髓系细胞触发型受体（TREM2）是小胶质细胞的表面受体，是小胶质细胞高度表达的与自身活化相关的蛋白，参与吞噬Aβ、修复受损神经元和清除细胞碎片的过程。近年来，基因组学研究发现，罕见的TREM2突变可显著增加阿尔茨海默病的发病机率。研究表明，TREM2缺失或单剂量不足都可导致AD模型鼠清除Aβ的能力明显下降。尽管基因突变可增加AD的发病机率，但是研究表明，年龄因素仍是AD发病的最主要因素。
　　多种疾病研究发现，TREM2的表达受核转录因子NF-κB的调控。NF-κB是一类关键的核转录因子，几乎在所有类型细胞的胞质中都有以异源或同源二聚体非活性形式存在的NF-κB复合物，与机体代谢、基因转录翻译和调控蛋白质表达等生命活动密切相关。NF-κB作为细胞信号转导途径的枢纽，具有广泛的生物学活性，能够在基因水平上参与炎症、肿瘤、免疫、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理、病理过程的调控。吡咯烷二硫代甲酸（PDTC）是一种可以透过细胞膜的特异性的NF-κB活化抑制剂，可以在多种细胞中抑制NF-κB的激活，产生相应的生物学活性。
　　目的：本实验通过提高类AD模型小鼠脑内TREM2的表达，促进小胶质细胞的增殖活化，进一步检测活化的小胶质细胞对AD模型鼠病理过程的影响及其产生作用的机制。
　　方法：
　　1.脑立体定位注射Aβ1-42到昆明小鼠单侧海马CA1区制备类AD小鼠动物模型。对侧侧脑室注射不同浓度的PDTC。实验小鼠分为：空白组、Aβ组、PDTC处理组（6 mg/L、8 mg/L、600 mg/L、800 mg/L），注射后第7天取材。
　　2.常规苏木素-伊红（HE）染色观察不同组中海马区损伤部位组织形态变化。
　　3.免疫组织化学检测不同组海马内Aβ的沉积，免疫组织化学和Western Blot检测海马区TREM2、CD11B、BDNF和DCX的表达。
　　4.免疫组织荧光技术检测海马区Aβ和小胶质细胞共表达、小胶质细胞和TREM2共表达。
　　结果：
　　1.HE染色结果显示:与空白组相比，注射Aβ各组小鼠海马区出现不同程度的损伤；Aβ组小鼠海马损伤区域最为明显，与Aβ组相比，给予PDTC处理后，PDTC各组海马区损伤明显减轻。
　　2.Aβ免疫组织化学检测结果显示:空白组海马区没有Aβ沉积，注射Aβ后各组模型鼠海马区均有Aβ沉积；其中，Aβ组海马区Aβ沉积最多，PDTC处理后海马区Aβ沉积明显减少，结果具有显著性差异（P＜0.01）。
　　3.TREM2免疫组织化学检测结果显示:与空白组相比，Aβ组海马区TREM2的表达降低，结果具有显著性差异（P＜0.01）；PDTC处理后，TREM2表达增加，与Aβ相比，差异具有显著性（P＜0.01）。且在一定范围内，TREM2的表达与PDTC剂量呈正相关,；CD11B免疫组织化学结果显示，空白组海马区小胶质细胞均匀分布，无聚集现象；Aβ组和PDTC各组海马区小胶质细胞在Aβ周围集中分布；与Aβ组相比，PDTC各组小胶质细胞表达增加，结果具有显著性差异（P＜0.01）。在一定剂量范围内与PDTC给药剂量呈正相关。
　　4.免疫组织荧光共定位检测结果显示:Aβ周围小胶质细胞大量聚集活化，Aβ沉积内有小胶质细胞的浸润；TREM2与小胶质细胞表达位置相关，具有共表达关系。
　　5.BDNF、DCX免疫组织化学检测结果显示:与空白组相比，Aβ组BDNF和DCX的表达均有下降，PDTC各组BDNF和DCX的表达上升，差异具有显著性（P＜0.01）。在一定范围内，BDNF和DCX的表达与PDTC剂量具有依赖关系。
　　结论：
　　1.PDTC干预调节小鼠海马内TREM2的表达。
　　2.TREM2表达增加，可激活小胶质细胞并维持特定小胶质细胞表型，从而清除Aβ和抑制炎症反应。
　　3.活化的小胶质细胞可能分泌与神经再生相关的神经营养因子如BDNF，促进神经元再生，改善AD病理状态。

目录

声明

第一章 序言

1.1研究背景

1.2研究目的、意义

1.3研究内容

1.4技术路线

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3数据统计

第三章 结果

3.1PDTC处理后各组小鼠海马内TREM2表达增加

3.2各组小鼠海马TREM2Westernblot半定量分析结果

3.3各组小鼠脑内小胶质细胞（CD11B）的表达

3.4各组小鼠海马CD11B表达Western blot半定量分析结果

3.5 小胶质细胞与TREM2共表达

3.6 TREM2表达增加对小胶质细胞形态的影响

3.7小胶质细胞与Aβ共表达

3.8小胶质细胞活化对小鼠海马内外源性Aβ代谢的影响

3.9各组小鼠海马内BDNF的表达

3.10各组小鼠海马齿状回颗粒层神经元(DCX)再生

3.11各组小鼠海马BDNF和DCX Western blot半定量分析结果

3.12PDTC处理后各组海马区损伤修复程度

第四章 讨论

阿尔茨海默病

TREM2

NF-κB通路调控TREM2的表达

小胶质细胞在中枢神经系统中的作用

TREM2、小胶质细胞与AD的关系

小胶质细胞与神经元再生

结论

参考文献

中英文缩写对照表

攻读硕士学位期间发表论文

致谢