HSYA与芍药苷联用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护及PI3K/Akt信号通路的影响

摘要

目的：⑴通过建立急性局灶性脑缺血再灌注损伤的模型，观察羟基红花黄色素A(HSYA)与芍药苷（Paeoniflorin）联合用药对大鼠脑组织梗死面积、神经功能缺失评分及病理变化的影响，探讨其抗脑缺血-再灌注损伤神经保护的协同作用；⑵通过观察全血中CD62的变化，探讨HSYA与芍药苷联合用药对血小板活化功能的协同抑制作用；⑶通过观察海马中磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)信号通路中PI3K mRNA（ρ110）、Akt mRNA（Akt1）基因表达和脑组织中p-Akt（Akt1）蛋白的表达变化，探讨HSYA与芍药苷联合用药对PI3K/Akt信号通路的协同作用；⑷综合以上指标，探讨HSYA与芍药苷联合用药对脑缺血-再灌注损伤的协同保护作用及对PI3K/Akt信号通路的可能机制。
　　方法：①SPF级雄性SD大鼠120只随机分为6组（每组20只）：HSYA组、芍药苷组、HSYA与芍药苷联合用药组（合用组）、银杏内酯组、模型组、假手术组。采用改良线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）的急性脑缺血-再灌注损伤的模型，脑缺血1小时再灌注6小时之后进行神经功能缺失的评分，剔除0分和未达预定时间死亡的大鼠，连续7d尾静脉给药，每天1次，并且每天观察各组大鼠的毛发光泽、精神状态、饮食饮水、体重变化等。给药量：HSYA组（5mg·kg-1）、芍药苷组（5mg·kg-1）、HSYA与芍药苷联合用药组（合用组）（HSYA5mg·kg-1+芍药苷5mg·kg-1）、银杏内酯组（5mg·kg-1），模型组及假手术组给予等量的注射用生理盐水。末次给药2小时后，再次神经功能评分后取材。②采用TTC染色的方法，测定各组脑梗死面积比，观察HSYA与芍药苷联合用药对脑梗死面积的影响。③采用HE染色法，观察HSYA与芍药苷联合用药对脑组织病理变化的影响。④采用流式细胞仪（FCM）法，测定大鼠全血中血小板活化标志物CD62P的活化程度，观察HSYA与芍药苷联合用药对血小板活化功能的影响。⑤采用免疫组化法（IHC），测定大鼠脑组织中p-Akt蛋白的表达，观察HSYA与芍药苷联合用药对PI3K/Akt信号通路Akt蛋白表达的影响。⑥采用定量逆转录PCR（qRT-PCR）法，测定大鼠右侧海马组织中PI3K mRNA、Akt mRNA基因表达，观察HSYA与芍药苷联合用药对PI3K/Akt信号通路中基因表达的影响。
　　结果：⑴与假手术组相比，模型组大鼠术后24h内体重明显减少（P＜0.01）；与模型组相比，合用组术后24小时内体重明显增加（P＜0.01）；与合用组相比，HSYA组、芍药苷组术后24小时内体重明显减少（P＜0.05）。⑵与假手术组相比，模型组大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能缺损评分变化（治疗前评分-治疗后评分）范围明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，芍药苷组、合用组、银杏内酯组脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损评分变化范围显著增加（P＜0.05， P＜0.01）；合用组与HSYA组、芍药苷组之间不存在统计学差异（P＞0.05）。⑶与假手术组相比，模型组大鼠的脑梗死面积显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，HSYA组、合用组、银杏内酯组脑梗死面积显著减少（P＜0.01，P＜0.05）；合用组与HSYA组、芍药苷组之间不存在统计学差异（P＞0.05）。⑷假手术组大鼠右侧脑结构完整，皮质区及海马区结构清晰完整，未见明显损伤及病变。模型组大鼠右侧大脑脑组织液化性坏死，结构不清晰，神经元细胞变性坏死，皮质区的损伤程度较海马区严重。银杏内酯组、HSYA组与芍药苷组大鼠海马CA1区部分细胞排列紊乱，细胞皱缩、体积缩小，并与周围的细胞分离，嗜酸性变及凋亡。HSYA与芍药苷联合用药组大鼠海马CA1区神经元细胞数目正常，排列规则，未见明显异常。⑸与假手术组相比，模型组大鼠全血中CD62P的活化程度明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，合用组、银杏内酯组全血中CD62P的活化程度明显降低（P＜0.05）；与合用组相比，芍药苷组全血中CD62P的活化程度显著增加（P＜0.01）；合用组与HSYA组之间不存在统计学差异（P＞0.05）。⑹皮质区p-Akt表达量明显的高于海马区（P＜0.01）。与假手术组相比，模型组脑组织中p-Akt的表达显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，HSYA组、芍药苷组、合用组、银杏内酯组p-Akt的表达明显增加（P＜0.01）；与合用组相比，HSYA组、芍药苷组p-Akt的表达明显降低（P＜0.01）。⑺与假手术组相比，模型组PI3K mRNA表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，HSYA组、芍药苷组、合用组、银杏内酯组均能显著降低海马组织中PI3K mRNA的病理性过度表达（P＜0.01，P＜0.05）；与合用组相比，HSYA组、银杏内酯组PI3K mRNA表达量明显增加（ P＜0.05）；合用组与芍药苷组之间不存在统计学差异（P＞0.05）。各组大鼠海马组织中Akt mRNA的表达量虽有差异，但无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：①HSYA与芍药苷联用对急性脑缺血-再灌注损伤具有协同保护作用，该作用产生可能与其明显降低脑缺血-再灌注大鼠的脑梗死面积及神经功能缺失评分、抑制术后24h体重下降、改善脑组织的病理性损伤及明显降低全血中CD62P含量有关。②HSYA与芍药苷联用对大鼠急性脑缺血-再灌注损伤的协同保护作用的分子机制可能与PI3K/Akt信号通路有关，通过抑制PI3K mRNA、Akt mRNA基因的病理性过度表达及上调Akt的磷酸化表达来发挥脑保护作用。

目录

声明

引言

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养条件

1.2 主要药物、试剂与仪器

1.3 主要药物及试剂的配置

2 实验方法

2.1 实验动物、分组

2.2 局灶性脑缺血-再灌注模型复制与评价

2.3 样本的采取

2.4 TTC染色

2.5 流式细胞仪法检测全血中CD62P的表达

2.6 病理切片及HE染色

2.7 免疫组化法检测脑组织中p-Akt蛋白表达

2.8 qRT-PCR法检测海马组织中PI3K/Akt通路中PI3K、Akt等相关基因表达量

2.9 统计分析

3 结果

3.1 HSYA与芍药苷联用对局灶性脑缺血-再灌注损伤的治疗作用

3.2 HSYA与芍药苷联用对CD62P活化程度的影响

3.3 免疫组化法检测PI3K/Akt信号通路中p-Akt蛋白的表达作用

3.4 qRT-PCR法检测PI3K/Akt信号通路中PI3K、Akt基因的表达作用

4 讨论

4.1 实验动物及实验模型的选择

4.2 HSYA与芍药苷联用改善局灶性脑缺血-再灌注损伤的理论基础

4.3 HSYA与芍药苷联用对脑梗死面积、体重变化、病理组织形态学及神经功能评分的影响

4.4 HSYA与芍药苷联用对局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠CD62P表达情况的影响

4.5 HSYA与芍药苷联用对局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠PI3K、Akt基因表达及p-Akt蛋白表达的影响

4.6 创新点与不足之处

5 结论

参考文献

综述:羟基红花黄色素A与芍药苷抗脑缺血作用实验研究进展

致谢

附录一 实验药物图片

附录二 实验动物质量合格证及实验动物实验证明

附录三 中英文缩写词对照

附录四 在读硕士期间的科研情况