MicroRNA调控上皮-间质转化的机制及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响

摘要

目的：
　　1.研究鼻咽癌耐药细胞株的相关特性、上皮-间质转化（EMT）相关表型，初步探讨EMT与鼻咽癌耐药、转移的关系。
　　2.研究鼻咽癌耐药细胞中microRNAs（miRNAs）的变化，并进一步筛选和验证差异表达的miRNA。
　　3.探讨miRNA调控EMT的机制及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响。
　　方法：
　　1. MTT法探讨不同浓度的顺铂(DDP)作用于鼻咽癌细胞 HNE1，HNE1/DDP24、48、72h后对细胞存活率的影响，以明确其剂量-效应关系和耐药指数；细胞生长情况采用不同时间（24、48、72、96、120、144、168h）计算鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的细胞数目；利用Western blot检测鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP中 MRP、Mcl-1、Bcl-2、Bax、Puma的蛋白表达水平；利用荧光定量 RT-PCR检测鼻咽癌细胞 HNE1、HNE1/DDP中 MDR1、MRP、Bcl-2、Bax的mRNA变化。
　　2.采用细胞划痕实验检测鼻咽癌细胞 HNE1、HNE1/DDP的迁移能力；利用transwell小室作细胞迁移实验与重组基底膜侵袭实验检测鼻咽癌细胞 HNE1、HNE1/DDP在体外迁移与侵袭能力；倒置光学显微镜观察细胞形态特征；利用Western blot检测鼻咽癌细胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin、MMP-9及转录因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表达；利用荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌细胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相关标志E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin、MMP-9及转录因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的mRNA变化。
　　3. MicroRNA（miRNA）芯片技术检测鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP中 miRNAs表达变化，并进一步筛选差异表达的miRNA；荧光定量 RT-PCR验证其差异表达的miRNA；利用 Western blot和荧光定量 RT-PCR检测鼻咽癌细胞 HNE1、HNE1/DDP中HIF-1α的表达水平。
　　4.将miRNA的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）转染进入鼻咽癌细胞中，荧光定量RT-PCR检测miRNA的变化，细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化， Transwell小室法检测细胞的侵袭和迁移能力变化，利用Western blot和荧光定量RT-PCR检测EMT相关标志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的变化，倒置光学显微镜观察细胞形态特征。
　　5.预测miRNA的潜在靶基因，利用Western blot和荧光定量RT-PCR检测调控miRNA对靶基因的影响；转染小干扰RNA，荧光定量RT-PCR检测mRNA的变化，细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化，Transwell小室法检测细胞的侵袭和迁移能力变化，倒置光学显微镜观察细胞形态特征，Western blot和荧光定量RT-PCR检测EMT相关标志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的变化。
　　结果：
　　1.鼻咽癌细胞HNE1/DDP对DDP具有耐药的特性
　　(1) MTT法显示：不同浓度的DDP(2、4、8、16、32μmol·L-1)在24、48、72h抑制鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的增殖，且随着DDP浓度的增加抑制作用增强。鼻咽癌细胞HNE1/DDP、HNE1在24、48、72h的半数抑制率(IC50)分别是29.04±2.82、19.44±1.77、11.39±1.89μmol·L-1和6.84±1.59、4.25±0.36、2.35±0.96μmol·L-1及其耐药指数(RI)分别为4.25、4.57、4.85，HNE1/DDP细胞相对于HNE1细胞对DDP不敏感，且在正常培养条件下，HNE1/DDP细胞相对于HNE1细胞生长缓慢。
　　(2) Western blot结果显示：HNE1/DDP细胞与HNE1细胞相比，MRP、Mcl-1、Bcl-2表达升高，但 Bax、Puma表达下降。荧光定量 RT-PCR结果显示：在HNE1/DDP细胞中， MDR1、MRP、Bcl-2表达上调和Bax表达下调。
　　2. HNE1/DDP细胞增加侵袭和迁移的潜能，并诱发EMT
　　(1)细胞划痕实验结果显示，HNE1/DDP细胞与HNE1细胞相比具有较强的迁移能力。Transwell小室法结果显示，HNE1/DDP细胞相对于HNE1细胞的体外迁移和侵袭能力明显增强。
　　(2)显微镜下观察细胞形态特征，HNE1细胞是细胞与细胞连接、集落生长、圆形、没有伪足形成，类似于上皮样；相对而言，HNE1/DDP细胞是细胞与基质连接、狭长、分散性生长、有伪足形成，类似于间质样。
　　(3) Western blot和荧光定量RT-PCR结果显示，HNE1/DDP细胞中上皮标志分子（如E-cadherin、β-catenin）的表达明显低于HNE1细胞，而HNE1/DDP细胞中间质标志分子（如Vimentin、Fibronectin、MMP-9）的表达明显高于HNE1细胞。此外，HNE1/DDP细胞中EMT相关转录因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表达明显高于HNE1细胞。
　　3.鼻咽癌细胞中miRNA的表达
　　MiRNA芯片结果显示，HNE1/DDP细胞与HNE1细胞相比有18种miRNAs表达上调和9种miRNAs表达下调。在这些miRNAs中，miR-10b是最具有差异表达的miRNA。在HNE1/DDP细胞与HNE1细胞相比中，荧光定量RT-PCR验证miR-10b具有25倍上调。同时，Western blot和荧光定量 RT-PCR结果显示， HNE1/DDP细胞中HIF-1α的表达明显高于HNE1细胞。
　　4. MiR-10b调控EMT及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响
　　(1)表达 miR-10b的HNE1细胞转染 miR-10b的模拟物，高表达 miR-10b的HNE1/DDP细胞转染miR-10b抑制剂。荧光定量RT-PCR结果显示，miR-10b模拟物能升高miR-10b的表达，而miR-10b抑制剂能抑制miR-10b的表达。
　　(2)划痕实验结果显示， miR-10b模拟物能明显增强 HNE1细胞迁移能力， miR-10b抑制剂降低HNE1/DDP细胞迁移能力。此外，Transwell小室法结果显示，miR-10b模拟物能明显增加HNE1细胞的迁移和侵袭细胞数，miR-10b抑制剂减少HNE1/DDP细胞的迁移和侵袭细胞数。
　　(3) Western blot和荧光定量RT-PCR结果显示，miR-10b模拟物能使HNE1细胞中E-cadherin减少和Vimentin、MMP-9增加，miR-10b抑制剂能使HNE1/DDP细胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9减少。显微镜下观察细胞形态特征， miR-10b模拟物能使HNE1细胞中出现更多的间质样细胞，miR-10b抑制剂能使HNE1/DDP细胞从间质样梭形细胞转化为上皮样细胞。
　　5. MiR-10b通过介导KLF4和Notch1对鼻咽癌细胞EMT的调控作用
　　(1)采用miRTarBase软件预测miR-10b的靶基因，其中KLF4和Notch1选作进一步研究。Western blot和荧光定量RT-PCR结果显示，HNE1/DDP细胞中KLF4的表达明显低于HNE1细胞，但Notch1的表达高于HNE1细胞。
　　(2) Western blot结果显示，miR-10b模拟物能使HNE1细胞中KLF4减少，miR-10b抑制剂能使 HNE1/DDP细胞中 KLF4增加。但荧光定量 RT-PCR结果显示， miR-10b的过表达或抑制对KLF4没有影响。Western blot和荧光定量RT-PCR结果显示，miR-10b模拟物能使HNE1细胞中Notch1增加，而miR-10b抑制剂能使HNE1/DDP细胞中Notch1减少。
　　(3)将鼻咽癌细胞HNE1/DDP转染Notch1 siRNA和对照siRNA，培养48h后， western blot和qRT-PCR检测Notch1表达减少。划痕实验结果显示，Notch1 siRNA能明显减少 HNE1/DDP细胞的迁移能力。此外，Transwell小室法结果显示， Notch1 siRNA能明显减少HNE1/DDP细胞的迁移和侵袭细胞数。
　　(4)显微镜下观察细胞形态特征，Notch1 siRNA能使HNE1/DDP细胞从间质样梭形细胞转化为上皮样细胞。Western blot和荧光定量RT-PCR结果显示，Notch1 siRNA能使HNE1/DDP细胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9减少。
　　结论：
　　1.顺铂耐药鼻咽癌细胞具有耐药的特性，进而诱发EMT变化且增加侵袭和迁移的潜能。
　　2.多个miRNA在鼻咽癌细胞中差异表达，可能在顺铂耐药和EMT中起重要作用。
　　3.过表达的miR-10b能促进HNE1细胞的侵袭和迁移，并且伴随着EMT的发生。相反，抑制miR-10b的表达能够逆转EMT。此外，miR-10b在转录后调控KLF4的表达，其在鼻咽癌细胞中可能通过KLF4调控EMT。
　　4. Notch1与miR-10b的变化水平相一致；Notch1基因敲除降低HNE1/DDP细胞的迁移和侵袭，并逆转EMT。在鼻咽癌细胞中，调控miR-10b减少Notch1的表达能够逆转EMT。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1. 材料与仪器

1.1细胞系

1.2试剂

1.3实验仪器

2.实验方法

2.1细胞培养

2.2 MTT法检测细胞存活率

2.3 细胞侵袭和迁移实验

2.4 荧光定量RT-PCR检测mRNA表达

2.5 miRNA芯片检测HNE1和HNE1/DDP细胞的miRNA表达谱

2.6 荧光定量RT-PCR检测miR-10b表达

2.7 细胞转染

2.8 免疫印迹法（western blot）检测蛋白的表达

3. 统计学处理

结果

1. 鼻咽癌细胞HNE1/DDP对DDP具有耐药的特性

1.1 DDP对鼻咽癌细胞的增殖能力的影响

1.2 鼻咽癌细胞的生长情况

1.3 鼻咽癌细胞的耐药和抗凋亡特性

2. 鼻咽癌HNE1/DDP细胞增加侵袭和迁移的潜能,并诱发EMT

2.1 鼻咽癌细胞的侵袭和迁移能力变化

2.2 鼻咽癌细胞发生EMT的特征变化

3. 鼻咽癌细胞中miRNA的表达

4. MiR-10b调控EMT及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响

4.1 调控鼻咽癌细胞中miR-10b的表达

4.2 调控miR-10b对鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力的影响

4.3 miR-10b对鼻咽癌细胞EMT的调控作用

5. MiR-10b通过介导KLF4和Notch1对鼻咽癌细胞EMT的调控作用

5.1 鼻咽癌细胞中miR-10b相关靶基因的表达

5.2 调控miR-10b对鼻咽癌细胞中KLF4和Notch1的影响

5.3 调控Notch1对鼻咽癌细胞HNE1/DDP侵袭和迁移能力的影响

5.4 Notch1对鼻咽癌HNE1/DDP细胞EMT的调控作用

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A 英中文术语缩略语表

附录B 常用试剂配制方法

附录C 个人简历及发表论文

附录D 综述:上皮-间质转化及相关microRNA分子与肿瘤细胞耐药的研究进展