马氏珠母贝皮连蛋白基因和Toll样受体3基因的克隆与功能研究

摘要

马氏珠母贝(Pinctada martensii)是我国海水珍珠养殖的主要贝类之一，具有十分重要的经济价值。课题组前期的研究中通过构建马氏珠母贝珍珠囊的转录组文库，应用新兴的RNA高通量测序(RNA-seq)技术结合生物信息学分析共得到51个矿化相关的unigenes和268个免疫相关的unigenes。本文主要对矿化相关的基因-皮连蛋白(dermatopontin，DPT)和免疫相关基因-Toll样受体3(Toll like receptor3，TLR3)进行克隆；荧光定量PCR分析其表达；RNA抑制(RNAi)技术验证其功能。
　　皮连蛋白是软体动物重要的壳基质蛋白，在贝壳和珍珠矿化形成中发挥重要的作用，本研究通过RACE技术获得了DPT全序列，该基因全长797bp，其中开放阅读框(open reading fragment，ORF)为537bp，5’-UTR为11bp，3’-UTR为249bp，polyA长为18个A，共编码178个氨基酸，N端包含一个长为22氨基酸的信号肽。预测其分子量约为21.36912KD，理论等电点为5.94。序列中共有6个磷酸化位点(丝氨酸4个、酪氨酸2个)，在N端第50个氨基酸处有一糖基化位点(NPSC，已去掉信号肽序列)，研究显示该位点与珍珠和贝壳的矿化作用相关。另外，序列中含8个Cys残基，Cys是介导蛋白质交联的氨基酸残基，说明DPT可以和珍珠层中的其他蛋白形成分子间二硫键，共同构建珍珠层的有机基质框架。与无脊椎动物DPT氨基酸序列比对发现，马氏珠母贝的DPT与九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)的DPT同源性40.1％，与光滑双脐螺同源性最低，为28.8％(Biomphalaria glabrata)。荧光定量PCR分析DPT在马氏珠母贝各个组织中的差异表达，结果表明DPT在外套膜中表达最高，其次是珍珠囊，而在腮中最低。利用RNA抑制技术抑制DPT的表达后，采用扫描电镜技术观察棱柱层和珍珠层结构的变化，与对照组相比，实验组棱柱层的超微结构没有明显的变化，而珍珠层的生长出现了无序，流失的现象。综上实验结果表明本研究克隆所获得DPT基因为马氏珠母贝基质蛋白基因，其可能通过与其他蛋白相互作用，共同构建珍珠层矿化的有机基质框架，从而在珍珠层的形成中发挥重要作用。
　　Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)是重要的模式识别受体(PRRs)，参与识别病原体相关的分子模式(PAMPs)，在天然免疫系统中起着非常重要的作用。本研究应用RACE技术，克隆得到TLR3长为894bp的部分序列，其中3’非编码区(3’-UTR)为385bp，编码168个氨基酸，末端有13个腺嘌呤的ployA尾巴。荧光定量PCR分析该片段在马氏珠母贝各个组织中都均有表达，其在血淋巴中表达最高，其次是闭壳肌中，在腮中表达最低。体外注射polyI：C可以显著性提高该片段及NF-κb的表达，利用RNA干扰技术抑制TLR3的表达后可以显著性抑制由polyI：C激活的NF-κb的表达。综上实验结果表明本研究所获得的TLR3片段在polyI：C激活的NF-κb的信号通路中发挥重要功能。