溶藻弧菌DLDH及DTD表达纯化及弧菌交叉免疫保护研究

摘要

以溶藻弧菌HY9901为模板,参照 GenBank上登录的其他溶藻弧菌菌株二氢硫辛酰胺脱氢酶基因及 D-酪氨酸-tRNA脱酰基酶基因序列设计引物,克隆了溶藻弧菌HY9901菌株的dldh和dtd基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明dldh基因含有一个1428bp的开放阅读框,编码475个氨基酸,预测其相对分子量为50.99 kDa,理论等电点为5.51,Blast分析发现溶藻弧菌DLDH与副溶血弧菌同源性高达99％,与哈维氏弧菌高达96%。而dtd基因全长435 bp,编码144个氨基酸序列,理论分子量为16.09,理论等电点为4.98,Blast分析发现溶藻弧菌DTD与副溶血弧菌同源性高达95%,与哈维氏弧菌高达96%。
　　将扩增到的dldh与dtd分别亚克隆到 pET-32a(+)质粒中,构建pET-DLDH,pET-DTD原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。蛋白表达条件优化分析,DLDH在37℃,IPTG浓度0.7 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大,重组蛋白主要以包涵体形式存在;DTD在37℃,0.1 mmol/L的IPTG浓度下诱导5 h时重组蛋白以包涵体形式大量表达。蛋白经纯化分析,并通过Western blot验证,表明表达蛋白正确。
　　利用基因的重叠延伸技术,将dldh及dtd两个基因通过三次PCR技术拼接到一起形成dldh-dtd,并构建原核表达载体,且在大肠杆菌中表达。蛋白表达条件优化分析融合蛋白在37℃、IPTG浓度0.4 mmol·L-1诱导4 h时蛋白表达量最高,蛋白主要以包涵体形式存在。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化分析,在咪唑150 mmol·L-1条件下达到最佳洗脱效果,将纯化的蛋白进行免疫印迹分析,在NC膜上可见与预测蛋白相符的清晰条带,说明融合蛋白成功表达。
　　将表达的DLDH、DTD以及 DLDH-DTD融合蛋白分别免疫斜带石斑鱼,Elisa法检测抗体效价表明,所有免疫鱼均有较高效价,与非免疫对照组差异显著(P<0.01),各重组蛋白免疫组在第四周时抗体水平达到峰值,而 DLDH-DTD最高,其次为DLDH,DTD抗体水平最低。在三种弧菌攻毒试验中,DLDH-DTD在溶藻弧菌攻毒下免疫保护率最高(95%),哈维氏弧菌及副溶血弧菌作用下分别为90%;DLDH在溶藻弧菌攻毒下保护率为90%,哈维氏弧菌及副溶血弧菌攻毒下分别为85%;而DTD免疫组相对较低,保护率分别为60%、55%、50%。由此可以认为重组蛋白可以作为弧菌交叉疫苗候选蛋白。
　　通过插入突变方法,构建dldh基因插入突变株,并研究了缺失株相关的表型变化。结果:dldh基因的突变,明显影响了溶藻弧菌的生长曲线、泳动能力(p<0.05)及生物膜形成能力(p<0.05),这为弧菌减毒疫苗鉴定了基础。

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1文献综述

1.1三种弧菌研究简介

1.2疫苗的研究进展

1.3 DLDH及DTD的研究进展

1.4本研究技术路线

1.5研究目的及意义

2溶藻弧菌dldh、dtd基因的克隆与原核表达

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与分析

2.4 讨论

3 DLDH-DTD融合表达载体的构建与表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 DLDH、DTD及DLDH-DTD融合基因表达产物对斜带石斑鱼的免疫效果

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

5 DLDH突变株的构建及功能研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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