波纹巴非蛤活性肽的酶法制备及其免疫活性的研究

摘要

波纹巴非蛤(Paphia undulata)是一种高蛋白、低脂肪、高营养价值的海产品,随着养殖面积不断扩大,波纹巴非蛤产量增大,但其加工技术未得到相应的提升,以带壳鲜销为主,精深加工技术欠缺,经济效益低。目前,采用酶技术制备生物活性肽成为研究的热点,利用低值蛋白资源制备活性肽制品是提高该原料经济效益的重要手段。本课题以波纹巴非蛤为原料,采用酶解技术、超滤、Sephadex G-25凝胶层析、RP-HPLC等方法,研究酶解工艺、确定了酶法制备活性肽的工艺参数,对活性肽进一步分离纯化,并对所获得的活性肽进行体外免疫活性评价。主要的研究结果如下:
　　(1)波纹巴非蛤是一种高蛋白(占原料的68.7％,以干基计)、低脂肪(占原料的4.02%,以干基计)海产品;分离提取的三种蛋白组分中占原料粗蛋白比例最高的是肌原纤维蛋白,其次为肌浆蛋白、基质蛋白;SDS-PAGE电泳分析显示:肌浆蛋白组分分子量分布比较广泛,在29.0 kDa-200 kDa之间,肌原纤维蛋白组分分子量大多介于66.4 kDa-200 kDa和29.0 kDa-38.0 kDa之间,基质蛋白组分在190 kDa、97 kDa、44 kDa、29 kDa附近有明显的条带;波纹巴非蛤蛋白组分中必需氨基酸含量较高,并且存在与免疫活性和抗氧化活性相关的氨基酸,如支链氨基酸、碱性氨基酸及疏水性氨基酸,这些氨基酸含量都较高;DSC分析结果显示,波纹巴非蛤肌浆蛋白、肌原纤维蛋白与基质蛋白组分的热变性温度分别为53.4℃、47.23℃和55.73℃。
　　(2)以水解度和DPPH自由基清除率为评价指标,选用4种蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)进行酶筛选实验,其中碱性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除活性显著高于其他3种蛋白酶(p<0.05),水解度也较高,因此选择碱性蛋白酶作为实验用酶;通过单因素试验和响应面试验优化酶解工艺,确定最优工艺条件为:温度50℃、加酶量4000 U/g(波纹巴非蛤肉)、时间3 h。
　　(3)探讨了DPPH自由基清除活性和淋巴细胞增殖活性之间的相关性,结果表明两者之间的相关系数为0.84,具有较好的线性相关性;以三倍体积、浓度为90%的乙醇对波纹巴非蛤酶解产物进行脱多糖处理,多糖脱除率为(89.21±2.63)%、肽回收率为(90.08±2.25)%;与空白相比,超滤组分(3 kDa-5 kDa、<3 kDa)具有较强的小鼠淋巴细胞增殖活性;研究了<5 kDa组分对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响,与空白对照组相比,浓度为0.6 mg/mL的未超滤组分和<5 kDa组分均能显著促进巨噬细胞的吞噬能力和IL-6分泌能力(p<0.05),各实验组对NO产生能力具有诱导作用,但没有显著性影响;与未超滤组分相比较,<5 kDa组分具有更好的增强小鼠腹腔巨噬细胞功能的作用。氨基酸分析发现波纹巴非蛤酶解产物未超滤组分和<5 kDa组分的氨基酸组成基本相似,但是<5 kDa组分的Val、Met和Phe含量明显比未超滤组分含量高,这三种氨基酸均与机体免疫功能有关,这也可以解释与未超滤组分相比较,<5 kDa组分具有更好的增强小鼠腹腔巨噬细胞功能的作用。
　　(4)与空白组相比,Sephadex G-25分离得到的P2(分子量范围为757 Da-2856 Da)和P3(分子量范围为634 Da-1229 Da)组分可以显著提高淋巴细胞增殖活性;通过Sephadex G-25分离得到4个峰的组分比较单一,说明Sephadex G-25使超滤组分得到了很好的分离,这为下一步鉴定奠定了基础;与空白组相比,Sephadex G-25分离组分对小鼠腹腔巨噬细胞功能均具有促进作用,其中P2(分子量范围为757 Da-2856 Da)和P3(分子量范围为634 Da-1229 Da)效果更好,高(0.6 mg/mL)、低(0.3 mg/mL)浓度条件下均能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞功能(p<0.05);Sephadex G-25分离组分对诱导巨噬细胞分泌 NO的效果均不及对诱导巨噬细胞吞噬能力和IL-6分泌能力的效果好。

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1 绪论

1.1 免疫活性肽及来源

1.2 免疫活性与抗氧化活性的关系

1.3 免疫活性肽的研究方法

1.4 波纹巴非蛤及其加工利用现状

1.5 以波纹巴非蛤进行免疫活性肽研究的可行性分析

1.6 研究目的意义及主要内容

2 波纹巴非蛤蛋白组成及其特性分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 本章小结

3 波纹巴非蛤酶解产物的制备

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 本章小结

4 波纹巴非蛤酶解产物的免疫活性评价

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 本章小结

5 波纹巴非蛤免疫活性肽分离纯化

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 本章小结

6 结论与展望

6.1 研究结论

6.2 研究展望

参考文献

致谢

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