应用15N同位素示踪技术初步探究PSTs在染毒牡蛎体内的蓄积

摘要

麻痹性贝类毒素（PSTs）是常见的天然微藻毒素之一，其来源众多、分布广泛、衍生物居多，且毒性较强。据不完全统计，全球每年因PSTs引发的中毒事件约2000起，死亡率高达15%。为此，很多国家和相关国际组织都严格管理与控制贝类水产品，并制定相应贝类水产品及其制品的PSTs限量标准。为了对PSTs进行更深入的研究，本实验通过稳定同位素15N示踪标记，驯化出产高丰度15N-PSTs的微小亚历山大藻藻种，然后对驯化得到的藻细胞中15N-PSTs进行分离纯化，最后对15N标记的PSTs在牡蛎体内的蓄积、分布情况进行了初步探讨，以期为PSTs在水产品体内的代谢机理分析、麻痹性结合蛋白（PSPBP）的研究以及其作为药物的开发应用提供理论基础和新思路。实验主要结论如下：
　　（1）应用15N-NaNO3替代f/2营养液中的氮源NaNO3，通过15N示踪标记方式驯化获得产高丰度15N-PSTs的微小亚历山大藻藻种。首先通过批次培养分析五种不同15N/P浓度对毒藻生长、产毒的影响以及PSTs萃取物中15N标记丰度变化情况，确定在15N/P浓度为1.5倍营养液氮磷含量时，藻细胞生理状况较佳。以此进行三个世代的传代培养，最终结果表明15N/P浓度等同于营养液中氮磷含量时，适用于驯化产高丰度15N-PSTs的藻种，经逐步富集培养，在第N代毒藻细胞中提取得到的PSTs粗品中，15N标记丰度达到82.36%，为将15N-PSTs作为示踪剂，深入研究其在贝体内的代谢机制提供理论基础。
　　（2）大量培养驯化所得的产高丰度15N-PSTs的微小亚历山大藻，提取足量高丰度15N-PSTs粗品，通过聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2色谱和羧酸型树脂Bio-Rex70离子交换色谱对其进行分离纯化，并应用 MBA法、荧光点法、HLPC-FLD和UPLC-MS/MS进行定量定性分析。结果表明实验所用毒藻仅含有GTX-1、-2、-3和-4，在优化后的分离纯化条件下可将GTX1/4和GTX2/3基本分开，制备所得纯品与标准品进行质谱比对分析，15N-PSTs中被引入的15N数目为2~6个，其中引入4个15N原子的概率最大。
　　（3）模拟自然海域牡蛎染毒环境，采用15N-PSTs粗提物（5 mg/L）＋湛江等鞭金藻（5.0×105 cells/mL）和与之等量的微小亚历山大藻（0.5×104 cells/mL）两种方式投喂近江牡蛎，通过保证实验投喂物流入和流出速度恒定（10 L/d）维持牡蛎接触的毒素量不变，进行为期2天的毒素蓄积实验，应用稳定同位素测定仪、MBA法和HPLC-FLD等方法对牡蛎各组织中15N丰度值、毒素毒力、组成和含量进行测定，分析15N-PSTs在牡蛎体内蓄积、分布和转化情况。实验结果表明，毒藻投喂组牡蛎毒素蓄积量（以内脏为参照）显著高于毒素粗品投喂组，依次为430.0 MU/100 g、342.5 MU/100 g。从分布来看，牡蛎闭壳肌、外套膜、腮和内脏团（消化腺、胰腺等）均有毒素检出，其中内脏为主要蓄积部位，其次为腮、外套膜和闭壳肌；牡蛎各组织与藻毒素组成成分存在差异，主要发生发生β型异构体向α型异构体转化和GTX2/3向GTX1/4的酶促转化。此外，牡蛎各组织15N标记丰度与PSTs毒性之间存在一定的正相关性，可为实验室PSTs在贝类体内的代谢研究提供新思路。

目录

1 前言

1.1 麻痹性贝类毒素的研究概况

1.2 稳定同位素 15N示踪法在海洋微藻中的应用研究

1.3 研究目的、意义和内容

2 产高丰度 15N-PST藻种的驯化

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

3 15N-PSTs的分离纯化

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

4 麻痹性贝类毒素在牡蛎体内的蓄积与分布规律

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.5 小结

5 结论与展望

5.3 展望

参考文献

致谢

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