H2S在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)抗氧化系统中的作用及其与NO的相互调节

摘要

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，其生物分类为弧菌科弧菌属，可引起人类和水产养殖动物患病。抗氧化系统是溶藻弧菌抵御各种胁迫的重要手段，而H2S和NO可能在调节溶藻弧菌抗氧化系统的过程中发挥着重要的作用。
　　该研究以溶藻弧菌总DNA作模板，克隆了溶藻弧菌抗氧化相关基因SOD、CAT、POD、GR和胱硫醚-β-合成酶基因 cbs，并推导了它们所编码的氨基酸序列。其中，主要对cbs基因进行了详尽的生物信息学分析，同时构建其原核表达载体 pGEX-cbs以表达重组蛋白。生物信息学分析结果显示，溶藻弧菌的CBS蛋白序列与各种细菌的相似性较高，与副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（V. harveyi）、创伤弧菌（V. vulnificus）、灿烂弧菌（V. splendidus）、霍乱弧菌（V. cholerae）的同源性分别为98%、94%、89%、83%、80%，表明CBS蛋白在弧菌中高度保守。其三级结构与果蝇的CBS蛋白A链相似性极高，这表明CBS蛋白在生物的进化历程中极其保守。原核表达结果发现，在37℃、0.6 mM的IPTG浓度条件下诱导5h目的蛋白的表达量最高，主要以包涵体形式存在。
　　测定了在不良环境条件下及NaSH预处理后溶藻弧菌的CBS活力以及以其抗氧化系统中SOD和POD的活力及GSH含量水平，结果表明溶藻弧菌能通过提高其CBS活力以增强其抗氧化系统能力，同时外源性H2S能提高溶藻弧菌抗氧化系统中的SOD活力及GSH含量水平。
　　根据溶藻弧菌抗氧化相关基因克隆后的序列设计 SOD、POD、CAT和 GR的荧光定量引物，然后对经不同浓度的外源气体供体NaSH及SNP预处理后的溶藻弧菌抗氧化相关基因进行相对定量分析，发现外源的H2S能显著上调抗氧化相关基因的表达量，而NO对溶藻弧菌的抗氧化系统的调节可能具有双重作用。此外，通过添加不同浓度的AOAA、HT、L-NAME和PTIO后测定溶藻弧菌相关指标，发现CBS酶活抑制剂AOAA能够下调 CBS和 NOS的活力，而 NOS酶活抑制剂反过来也能降低NOS和CBS的活力。相似的，H2S清除剂可以降低H2S和NO含量，而NO清除剂在清除NO的同时也能下调H2S的累积量。这说明，CBS和NOS之间，或者是H2S和NO之间，可能均存在着协作效应。
　　此外，本研究还发现，在诺氟沙星胁迫下，H2S和NO之间可能存在着相互应答机制，以上调溶藻弧菌的抗氧化系统。

目录

声明

英文缩略词

1 文献综述

1.1 溶藻弧菌的研究进展

1.2 H2S在生物代谢中的作用研究进展

1.3 H2S与NO

1.4 本研究技术路线

1.5 研究目的及意义

2 溶藻弧菌抗氧化相关基因、胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、cbs生物学信息分析及其原核表达

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3 溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶活力与其抗氧化系统的关系

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

4 不同外源添加物下溶藻弧菌相关指标的变化

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

5 溶藻弧菌在诺氟沙星胁迫下H2S和NO的相互作用

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

6 总结

参考文献

致谢

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