鲍鱼养殖水系中霍乱弧菌基因水平转移的初步研究

摘要

霍乱毒素基因(choleratoxin gene,ctxAB)可以通过溶源性丝状噬菌体(CTX φ)发生水平转移,因此,基因水平转移在霍乱弧菌(Vibrio cholerae,VC)的进化中有着举足轻重的作用.随着致病性VC也是水系中常在菌观念的确立,环境因素对ctxAB基因转移的影响成为人们研究的热点.故该研究在初步调查致病性VC携带溶源性噬菌体的基础上,建立了追踪致病基因的原位PCR-流式细胞仪(in situ PCR-flowcytometry,ISPCR-FCM)分析法.并在鲍鱼养殖水系中,运用该方法进行了VC基因水平转移的初步研究.以丝裂霉素C为诱导剂,调查了VC携带溶源性噬菌体的情况.结果表明在丝裂霉素C诱导作用下,约18.75％(3/16)菌株产生携带ctxAB基因的丝状噬菌体CTXφ;一株O139群霍乱弧菌分泌出一种单条型丝状噬菌体,其性质不详;未检测出可以转移毒素共协调菌毛(toxin-coregulated pilus,TCP)的溶源性丝状噬菌体(Vibrio cholerae pathogenicityisland phage,VIP φ).VC经固定和溶菌酶消化处理后,根据常规PCR确定的扩增参数进行细胞内ctxAB基因的原位扩增.FCM分析显示阳性率达100%.裂解细菌,获取扩增产物,琼脂糖凝胶电泳检测和测序的结果表明扩增产物是ctxAB基因的序列.多次重复试验结果一致.该方法的灵敏性达104个/ml.至此,建立了原位检测细菌内特异基因的ISPCR-FCM分析法.以鲍鱼养殖水系为研究对象,考察该水系中ctxAB基因的水平转移情况.同时,检验ISPCR-FCM分析法在实际工作中的应用.结果显示,由于未检出ctxAB+菌株,故无法评估VC基因水平转移事件.ISPCR-FCM分析法在实际运用中,其灵敏性、背景干扰以及流式细胞仪的分选工作等方面尚存在问题,需进一步研究改善.

目录

学位论文原创性声明

缩略词

前 言

第一部分致病性霍乱弧菌溶源性噬菌体的调查

材料与方法

结果

讨 论

第二部分原位PCR联合流式细胞仪检测ctxAB方法的建立

材料与方法

结果

讨 论

第三部分鲍鱼养殖厂水系中细菌携带ctxAB基因的调查

材料与方法

结果

讨 论

小 结

创新点

本研究的局限性与今后的研究方向

参考文献

综 述

浅谈细菌基因的水平转移

致病性霍乱弧菌进化的研究进展

致 谢