聚合酶链反应中抑制物的检测及去除方法研究

摘要

目的:恶性淋巴瘤一直是病理诊断的难点.PCR以其快速、灵敏、易于操作等优点成为众多领域的首选技术.近年来,PCR检测基因重排已经成为淋巴瘤诊断不可缺少的手段.然而,假阴性一直是困扰PCR结果的问题之一.尤其是由于PCR抑制物的存在,常常导致PCR出现假阴性结果,影响淋巴瘤的正确诊断.目前,关于抑制物问题,国内尚未见系统研究.因此,如何检出DNA模板中抑制物的存在,通过必要的方法使之去除,同时探究导致PCR假阴性的其他因素,改进固定、DNA提取以及PCR反应中的不适环节,从而提高基因重排的阳性率,成为该课题研究的重点内容.方法:(1)构建一含有β-globin基因片段的重组质粒,作为检测DNA提取物中是否含有PCR抑制物的内对照,在PCR反应中作为目的基因扩增的模板.选取以淋巴组织为主的新鲜及石蜡组织进行分组,有目的地对新切蜡片和陈旧蜡片设立对照,常规PCR筛查阴性标本,加入内对照体系检测抑制作用的有无.(2)以淋巴瘤细胞系DG75细胞DNA作为PCR反应的模板,选择固定、包埋、HE染色以及消化裂解法.观察不同试剂不同浓度对PCR反应的影响.(3)采用10％福尔马林、95%乙醇、中性缓冲福尔马林、4%多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液(pH7.3)作为固定剂,0.1M PBS作为对照组.(4)将第一部分实验中β-globin检测阴性的DNA提取物,分别进行如下处理:加热、稀释、BSA孵育,BamHI、EcoRI、HindⅢ内切酶消化,观察各种方法对阴性标本的处理效果,找出合适的处理方法,为淋巴瘤基因重排检测提供较为可靠的技术保证.

目录

英文缩写词中英文对照表

前言

第一部分：福尔马林固定石蜡包埋组织中PCR抑制物的初步探究

材料与方法

结果

讨论

第二部分：影响PCR部分因素分析与抑制物去除的方法研究

材料与方法

结果

讨论

全文小结

存在的不足及今后努力方向

参考文献

综述 DNA模板中PCR抑制物研究进展

参考文献

在读期间撰写论文

致谢