TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型

摘要

目的:该研究采用分子克隆、骨髓源神经干细胞培养和脑立体定向细胞移植等实验技术,将hTH基因分别构建入pEGFP-C2和pcDNA3.1His真核表达载体中,构建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH.同时,纯化提取pEGFP-C2质粒,酶切鉴定后分别转入培养的骨髓源性神经干细胞,体外进行其基因表达情况的观察,证实成功表达后,将转染的骨髓源性神经干细胞定向注射入经右颈总动脉注射MPTP制作的偏侧恒河猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位.移植后定期观察恒河猴的动作行为变化.5个月后行头部<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1SPECT检查,分别观察细胞移植后脑内的代谢、结构和脑内DA能神经元的分布.最后,免疫组织化学观察移植细胞的分布情况.结论:该研究采用分子克隆技术成功构建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH、纯化并提取了pEGFP-C2真核表达表达质粒.应用Nucleofector<'TM>核转染技术成功地将His、hTH和EGFP基因转入体外培养的骨髓源神经干细胞.所培养的细胞表达Nestin和CD133抗原,并能分化为神经元样细胞和胶质细胞样细胞,免疫细胞化学检测可见NSE、GFAP和β-tublin抗原阳性表达.而后应用RT-PCR、免疫细胞化学等技术对基因修饰细胞进行目的基因表达情况的测定,发现目的基因都有效长期表达.随后应用脑立体定向细胞移植技术将基因修饰细胞自体移植入偏侧恒河猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位.通过术后阿扑吗啡诱导、<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1 SPECT检测发现细胞移植后对动物的PD行为有所缓解,较模型猴脑内代谢有所改善、右侧黑质-纹状体区DA能神经元有所增加,移植区域的结构也有相应改变.细胞移植6个月后免疫组织化学显示TH免疫反应阳性细胞数量有相应增加,而且EGFP、His和Brdu标记明确地显示出移植细胞的分布和迁移情况,能有效地与自身细胞进行区分,为下一步骨髓源神经干细胞自体移植活体示踪的实施提供了实验依据.

目录

中英文缩略词对照表Chinese-English mini-terminology synopsis

前言

总材料和方法

一 实验动物

二 主要仪器设备

三 药品与试剂

四 主要溶液及配置方法

五 总方法

第一部分 骨髓基质细胞源神经干细胞体外培养、生物活性物质的检测和抗原鉴定

第二部分构建pEGPF-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH重组质粒和基因转染NSCs-BMSCs

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分恒河猴PD模型的制备和基因修饰NSCs-BMSCs自体移植

全文小结-Summary of full text

参考文献

附图说明

综述Ⅰ-Summarization one 神经干细胞基因转导治疗帕金森病的研究进展

综述Ⅱ-Summarization Two 帕金森病基因治疗实验研究进展

个人简历

致谢-Acknowledge