乙型脑炎病毒及黄热病病毒寡核苷酸检测芯片初步研究

摘要

乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JEV)引起，经蚊虫叮咬传播的一种传染性疾病。该病能引起严重的脑炎，往往会导致永久性的大脑损伤，且死亡率高。全球大概每年有35，000-50，000例乙型脑炎患者，该病主要分布于亚洲地区。 黄热病由黄热病病毒(YFV)引起，曾在南美洲、非洲等热带地区引起大范围的流行，每年估计有200，000例黄热病患者(30，0001例死亡)。 JEV与YFV同属于黄病毒属，病程早期对疾病诊断都有一定困难。由于目前尚无有效手段阻止或延缓病程发展，因此早期实验室检测(JEV/YFV)对于迅速做出诊断，确立正确的治疗方案、避免误诊、贻误病程有重要意义。 传统的实验室诊断方法往往依赖于免疫学方法检测病毒抗原。由于JEV、YFV与其它黄病毒之间会产生血清学交叉反应，所以传统的诊断方法容易产生假阳性结果。基于RT-PCR技术的分析方法也被应用于检测JEV、YFV，但也无法避免假阳性和假阴性结果的产生。 基因芯片技术代表着分子技术领域的最新发展，具有快速诊断和敏感的核酸分析能力。该技术在微生物分析、病原体检测、基础和应用环境科学的监控等方面都具有广阔的应用前景。 本研究首先运用生物信息学软件如BLAST，0ligo6.0，DNAClub，筛选出特异性高，长度一致，Tm值相近的寡核苷酸探针，经BLAST比对排除非特异性探针。分别针对JEV及YFV设计并合成了17和19条寡核苷酸探针，各自用于点样制备寡核苷酸检测芯片。 采用正常人血清总RNA、登革热病毒质粒、丙型肝炎病毒质粒作为阴性对照样品。克隆有JEV、YFV基因的质粒样品用于验证探针。通过采用限制性荧光标记技术进行全基因组扩增标记，标记产物纯化后与芯片进行杂交。采用激光共聚焦扫描仪进行扫描，GenePix6.0软件采集图像并进行图像分析，对探针进一步筛选。 探针初步筛选后，应用于制备JEV，YFV联合诊断芯片。限制性荧光标记样品倍比稀释后与Oligo芯片杂交，分析芯片检测的灵敏度。 以A/T克隆分别将NS1、NS2a、NS2b、NS4a和NS4b基因片段与pMD18-T载体连接，应用常规PCR和不对称PCR两种方法进行掺入荧光标记，将荧光标记样品与寡核苷酸芯片杂交，在相同条件下完成杂交清洗和芯片的扫描检测。发现应用不对称PCR技术对样品进行荧光标记后，与寡核苷酸芯片杂交能提高芯片的杂交效率。同时实验中发现探针不同的杂交效率可能与其距靶片段3’端位置的距离有关。 本课题通过实验室研究，得到以下实验结果：(1)比较在不同退火温度下限制性显示扩增的情况，结果表明选用退火温度为55℃30s，58℃30s，60℃30s时，扩增效率较佳。 (2)运用倍比稀释的方法分析60mer寡核苷酸芯片检测的灵敏度，结果可得芯片检测的灵敏度不低于0.04ng/μl(0.15nmol/l)。 (3)经过初步的杂交分析，排除部分非特异性探针后，将筛选出的28条寡核苷酸探针用于制备JEV和YFV联合诊断芯片。 (4)发现探针位于靶片段远3’端位置时，其杂交信号显著低于近3’端位置的探针。 综上所述，研究中我们将限制性显示PCR与芯片技术相结合，用于JEV及YFV检测芯片的初步研究，为将该技术运用于病原体临床检测打下基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章JEV、YFV寡核苷酸芯片的制备及初步杂交分析

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第二章应用不对称PCR技术提高寡核苷酸芯片的杂交效率

2.1 实验材料与方法

2.2结果

2.3讨论

结论

参考文献

附录

成果

致谢

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