艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区的克隆、表达及其生物学特性研究

摘要

目的：艰难梭菌(Clostridiumdifficiie)是造成抗生素相关性结肠炎及伪膜性结肠炎(PMC)的最常见致病菌。该菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相关性腹泻及肠炎的发病率及死亡率明显升高。Cdifficile产毒株准确快速的诊断、鉴定，对确定病源、控制其传播、有效治疗患者是极其重要的。国外建立的酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Cdifficile毒素，其优点是灵敏度和特异度高，结果可在2-4小时内得出，从而更适合指导临床实际工作，故被大力推广，但国内对艰难梭菌诊断试剂研究较少，尤其是对Cdifficile细胞毒素B(cdtB)的检测。本课题利用cdtB特点，以基因工程技术对其羧基末端功能区进行克隆、表达并纯化出该蛋白，制备多克隆抗体，主要目的在于对该重组蛋白生物学特性进行研究和探索，以期建立一种可快速、稳定的检测出Cdifficile细胞毒素B的ELISA诊断试剂。 方法：1、基因工程技术制备cdtB膜受体结合区域的重组蛋白。以Cdifficile标准株VPI10463的全长DNA序列为模板，利用PCR技术扩增出编码cdtB膜受体结合区域的功能基因，经EcoRI和XhoI双酶切后，定向插入同样经这两种酶双酶切的原核表达载体pET-22b(+)中，在DNAT4连接酶作用下进行连接以获得重组质粒。重组质粒经测序，结果与GenBank记录的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比对。将正确的重组子转化至E.coliBL21(DE3)细菌中，经IPTG诱导表达出特异性蛋白，利用SDS-PAGE检测重组蛋白。 2、亲和色谱法纯化重组蛋白并进行WESTERN-BLOT分析。因表达载体pET-22b(+)具有His.Tag序列，故与固定化金属离子(Ni2+)之间具有亲合力，金属螯合到固相支持物共价结合的反应性基团亚氨二乙酸(IDA)上，用咪唑将重组蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的。本研究选用NOVagen公司的His.Tag亲合纯化产品-His.Bind树脂和缓冲液试剂盒。纯化后采用CoomassiebrilliantblueG-250比色法，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma)为标准建立标准曲线，测定重组蛋白浓度；并利用His.tag单克隆抗体与重组蛋白进行WESTERN-BLOT分析。 3、多克隆抗体制备及其生物学特性的研究。以纯化重组蛋白为抗原，免疫纯种雄性新西兰大白兔，在第4次加强免疫后第10天，制备多抗血清，利用双向免疫扩散法和间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测抗体效价，同时检测重组蛋白和从NOVagen公司购得的Cdifficile细胞毒素B这两种材料的抗原相关性。以重组蛋白与制备的多抗血清进行WESTERN-BLOT分析以检测抗体的特异性。用自制的多克隆抗体通过间接ELISA法对5株艰难梭菌产毒株、2株大肠杆菌、1株双歧杆菌进行艰难梭菌B毒素检测。 结果：1、利用PCR技术扩增出编码cdtB膜受体结合区域的功能基因为1848bp，经测序与相应Cdifficile标准株VPI10463序列区域的基因完全相同。目的基因与原核表达载体pET-22b(+)连接后获得的重组质粒，测序结果与GenBank记录的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比对符合率达99％。将经鉴定的cdtBR阳性克隆子在IPTG的诱导下表达，然后进行10％SDS-PAGE电泳分析，结果发现，经诱导后表达的重组蛋白相对分子质量为71300，与预期的蛋白大小一致。 2、根据金属螯合亲和色谱法在非变性条件下纯化重组蛋白，纯化后的可溶性重组蛋白相对分子质量为71300，有少许降解，纯度达到90％。重组蛋白纯化后根据CoomassiebrilliantblueG-250chromatometry比色法测出的蛋白浓度为0.762mg/ml。免疫印迹试验说明重组蛋白与HisTag单克隆抗体可以发生特异性结合 3、获得了相应的多克隆抗血清，重组蛋白的抗原性是Cdifficile细胞毒素B抗原性的一部分。WESTERN-BLOT分析：抗艰难梭菌B毒素膜受体结合蛋白多克隆抗体可以和重组蛋白cdtBR结合，与E.coli菌体裂解蛋白有非特异性的反应。间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定抗体效价均为1：10000以上。自制多克隆抗体对8株临床细菌进行艰难梭菌B毒素检测显示，3株艰难梭菌产毒株、1株大肠杆菌为阳性结果，其余为阴性结果。 结论l、本研究参考Cdifficile国际标准株VPI10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列。蛋白电泳分析表明获得了高效表达的CdifficileToxinB3克隆株。 2、本研究利用基因工程得到的重组蛋白，western-blot证实表达的蛋白与本研究所设计相一致。为进一步研究CDAD的诊断试剂和免疫保护作用奠定了重要的实验基础。 3、通过动物实验本研究发现，重组蛋白具有良好的免疫原性，该多克隆抗体具有良好的生物学活性、较好的特异性。但因为是多克隆抗体，故特异性不高，需要更深入地研究此重组蛋白，最终制备单克隆抗体，为Cdifficile感染的临床诊断提供特异性的诊断试剂。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章艰难梭菌B毒素膜受体结合区蛋白的克隆及表达

1.1引言

1.2材料与方法

1.3结果

1.3.1菌株特点

1.3.2 pET-cdtBR重组质粒的构建

1.3.3pET-cdtBR重组质粒的DNA测序结果

1.3.4cdtBR基因在大肠杆菌中的表达

1.4讨论

第二章重组蛋白的纯化及免疫原性的体外评价

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.3.1重组蛋白的纯化

2.3.2重组浓度测定

2.3.3重组蛋白的抗原性

2.4讨论

第三章抗艰难梭菌B毒素膜受体结合蛋白多克隆抗体的制备及特性分析

3.1引言

3.2材料和方法

3.3结果

3.3.1多克隆抗血清的制备

3.3.2特异性鉴定

3.3.3 ELISA的特异性检查

3.4讨论

课题总结

参考文献

英文缩写词对照表

成果 读硕期间撰写论文情况

致谢

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