柴胡皂甙抗实验性癫痫的药效学及其作用机制研究

摘要

一、目的与意义 癫痫(epilepsy)是一种古老的世界性疾病，我国流行病学调查结果显示癫痫的患病率为7.0％0，活动型癫痫的患病率为4.6％0，我国约有900万人罹患癫痫，其中600万人每年都有发作。由于社会传统的偏见，癫痫病人及家属常隐瞒或否认自己的病情，并承受很大的心理压力，由癫痫引起的医疗、家庭和社会问题也不容忽视。 目前控制癫痫仍以化学药物为主，常用的一线抗癫痫药(AEDs)可使70％～80％各类型的癫痫患者发作得以控制，但长期应用安全性较差，对于一些难治性癫痫可选择外科手术治疗，但受到适应症的限制，风险大，费用昂贵，还存在复发的可能，因此难治性癫痫目前仍然以药物治疗为主要手段，这就需要使用新的抗癫痫药物。如何发挥中医药抗癫痫的作用就成了摆在我们面前的课题，而单味中药的活性成分研究不但能明确其抗癫痫的机制，更有利于促进中医药现代化。 近年来癫痫的发病机制研究有了长足进步。神经元兴奋性增高和高度同步化发放是癫痫发病的两个重要特征已得到公认，国内外很多学者试图从多个方面来探索引起神经元兴奋性增加和高度同步化发放的形成机制，提出了不少有益的见解，其中对星形胶质细胞与神经突触信号传递的认识逐渐深入。位于突触联合处的星形胶质细胞被认为是突触三联复合体的重要组成部分，当神经系统损伤时星形胶质细胞可由常态转变为反应性星形胶质细胞，其组织学特征表现为星形胶质细胞的肥大和增生，生化标志则是星形胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量的增加，GFAP为星形胶质细胞的特异性标记物，GFAP的高表达，在某种程度上提示星形胶质细胞的蛋白合成和运输等功能活动处于一种活跃的状态，是星形胶质细胞激活的标志之一。另外，兴奋性神经递质和抑制性神经递质在脑内的异常变化，以及二者的平衡失调与癫痫的发生密切相关，而γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)是脑内一对重要的抑制性和兴奋性神经递质。海马是中枢神经系统内诱发癫痫最敏感的脑区，人们常选择其作为研究癫痫的靶区。 中药柴胡性苦、微寒，属辛凉解表药，归肝、胆经，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举陷之功。近年来国内外对柴胡的药学、药理学及临床应用进行了广泛的研究。柴胡的主要成分含有皂甙、挥发油、有机酸、甾醇类、黄酮类、多糖等，具有抗炎、免疫调节、促进皮质酮分泌、抑制Na+-K+-ATP酶等作用，可抗肿瘤，对消化系统、心血管系统、呼吸系统等均有作用，柴胡或以柴胡为君药的复方在临床上被广泛应用。 导师陈宝田教授多年来运用“柴胡疏肝汤”治疗难治性癫痫，取得了肯定的疗效，动物实验也提示“柴胡疏肝汤”能抑制戊四氮慢性点燃大鼠的痫性发作，并能抑制鼠大脑皮层和海马c-fos的表达，提高bcl-2/bax的比值，从而减少大鼠海马和额叶的神经细胞凋亡。前期我们研究了该方中君药“柴胡”及柴胡皂甙的抗实验性癫痫作用，发现柴胡具有明显的镇静和抗惊厥作用，柴胡皂甙具有抗青霉素致痫作用。为了进一步研究柴胡总皂甙抗癫痫的效应及可能的作用机制，并期望阐明柴胡总皂甙中何种单体成分具有抗实验性癫痫的作用，拟进行柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠痫性发作及其抗最大电惊厥的影响，并运用免疫组化技术探讨柴胡总皂甙对慢性点燃大鼠海马内星形胶质细胞GFAP的表达及GABA、Glu阳性细胞表达的影响，为筛选良好的抗癫痫中药有效成分提供必要的理论及实验依据。 二、方法与内容 1.柴胡总皂甙对小鼠最大电惊厥的影响 最大电惊厥(MES)是国际上通用的癫痫大发作动物模型，由于用电刺激诱发的小鼠后肢强直性伸展可被抗癫痫药(AEDS)阻断或抑制，该方法常被用于筛选治疗癫痫强直—阵挛发作的药物。Merritt和Putnam就曾用MES技术筛选发现了苯妥英钠(PHT)，其他还有卡马西平(CBZ)、苯巴比妥(PB)等也由MES法初选。可见MES惊厥是研究癫痫大发作的重要模型之一。 在MES模型中采用100V、2Hz单次刺激方式，以小鼠后肢强直性伸直为指标，观察柴胡总皂甙高、中、低三个剂量组对小鼠MES的作用，记录小鼠惊厥数和惊厥率，并与苯巴比妥钠组、生理盐水组相比较。 2.柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠痫性发作及脑电图的影响 在PTZ慢性点燃模型中将48只健康SD大鼠随机均分为6组，即空白组(A组)、生理盐水组(B组)、丙戊酸钠(VPA)组(C组)和柴胡总皂甙高、中、低三个剂量组(D组、E组、F组)，除空白组不做处理外，其他各组采用腹腔注射PTZ32.5mg/kg进行慢性点燃造模，造模同时给予以上不同处理因素，连续4周，每日记录大鼠痫性发作级别及次数，最后描记大鼠脑电图。 3.柴胡总皂甙抗PTZ慢性点燃大鼠痫性发作的机制研究 柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠海马GFAP、GABA、Glu的影响：按常规灌注后取脑组织切片进行GFAP、GABA、Glu免疫组化染色，从阳性细胞数、阳性细胞灰度值及截面积等分析结果。 4.柴胡皂甙a、c、d对MES惊厥小鼠的影响 在明确柴胡总皂甙的抗实验性癫痫作用后，采用最大电休克发作(MES)导致小鼠惊厥模型，通过记录小鼠惊厥数和惊厥率的变化，研究三种主要的柴胡皂甙单体柴胡皂甙a、柴胡皂甙c、柴胡皂甙d(SSa、SSc、SSd)抗小鼠MES惊厥作用，以期筛选有效单体成分。仍采用100V、2Hz单次刺激方式，观察SSa高、中、低三个剂量组、SSc中剂量组、SSd中剂量组对小鼠MES的作用，并与苯巴比妥钠组、生理盐水组相比较。 5.柴胡皂甙a对PTZ诱导小鼠痫性发作的影响 对采用MES模型筛选的有效单体成分柴胡皂甙a(SSa)，进行抗化学致痫作用的研究，探讨SSa高、中、低三个剂量组对PTZ诱导小鼠急性癫痫模型作用，通过记录小鼠痫性发作潜伏期和强直性惊厥率的变化，研究SSa对PTZ致小鼠急性癫痫模型的痫性发作的影响，并与丙戊酸钠组、生理盐水组相比较。 6.动态观察柴胡皂甙a对实验性癫痫小鼠痫性发作的影响 在柴胡皂甙a有效剂量研究基础上，继续对柴胡皂甙a抗实验性癫痫的作用时间特点进行探讨。研究采用PTZ诱导小鼠急性癫痫模型，通过记录不同时间点(30min、60min、90，min、120min)对小鼠痫性发作潜伏期和强直性惊厥率的变化，研究SSa对PTZ致小鼠急性癫痫模型的痫性发作影响的动态特征，并与丙戊酸钠组对照。 三、结论 1.柴胡总皂甙具有较好的抗小鼠MES惊厥作用，并可拮抗PTZ慢性点燃大鼠的痫性发作，有一定的对抗PTZ慢性点燃作用。 2.柴胡总皂甙可以抑制PTZ慢性点燃大鼠海马星形胶质细胞GFAP的过度表达，能较好地抑制慢性点燃大鼠海马星形胶质细胞的异常激活，这可能是其抗PTZ慢性点燃效应的作用途径之一。 3.柴胡总皂甙可以抑制PTZ慢性点燃大鼠海马谷氨酸阳性细胞表达，对PTZ慢性点燃大鼠海马区GABA阳性细胞的表达也有抑制作用，并与柴胡总皂甙存在一定量效关系。柴胡总皂甙对慢性点燃大鼠海马神经元内谷氨酸和GABA变化的影响，可能与柴胡总皂甙抗PTZ慢性点燃效应有密切联系。 4.在柴胡总皂甙的主要单体成分中(研究SSa、SSc、SSd)，以柴胡皂甙a的抗小鼠MES惊厥效应最明显，而SSc、SSd抗小鼠MES惊厥作用不显著。进一步研究发现SSa也能对抗PTZ诱导小鼠的痫性发作，对小鼠的强直性惊厥发生有较好的保护作用，并且存在量效关系；不同时间小鼠腹腔注射SSa抑制PTZ诱导小鼠的痫性发作在120min内以60min、90min的效应较强。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章柴胡总皂甙抗实验性癫痫的药效学研究

第二章柴胡总皂甙抗实验性癫痫的作用机制研究

第三章柴胡皂甙a、c、d抗实验性癫痫的药效学研究

全文小结

参考文献

附录

攻读博士学位期间成果

致谢

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