补肾中药血清对破骨细胞的生物学作用及OPG/OPGL与破骨细胞活性的相关性研究

摘要

目的：1.探讨补肾中药(骨灵丸)血清的最优提取方法；2.观察补肾中药血清对体外培养破骨细胞骨吸收功能的影响；3.探讨补肾中药血清对破骨细胞RANK基因表达水平的影响；4.探讨补肾中药对成骨-破骨细胞共育体系中护骨素/护骨素配体的蛋白及基因表达水平的影响及与破骨细胞活性的相关性。 方法：1.按处方配制补肾中药，传统方法熬煮中药，水浴锅浓缩至252ml，SD大鼠36只随机分成空白组(生理盐水2ml)、低剂量组(生药1.77g/次)、中剂量组(生药3.54g/次)、高剂量组(生药7.08g/次)，每日早晚2次灌胃，共3天，第4日末次灌胃后1小时采血，离心，吸取血清，大部分血清56℃，30分钟灭活保存，部分用于干预成骨细胞试验；取SD胎鼠的头盖骨分离培养获得纯化的成骨细胞，使用MTT比色分析方法在酶标仪上测试灭活前后血清干预的成骨细胞增殖情况，记录每组A570值；对硝基苯磷酸盐法(PNPP)测各组碱性磷酸酶活性，使用SPSS10.0软件包的配对T检验比较灭活前后血清对成骨细胞生物学作用的差别; 2.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分离培养破骨细胞(OC)，差异贴壁法获得纯度在95％以上的破骨细胞，分成低、中、高、空白对照四组，每组6孔，施加相应浓度的补肾中药血清，对照组采用无中药血清，培养24小时，酶动力学法测定培养上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，甲苯胺蓝染色骨吸收陷窝并在图像分析仪下测定骨吸收陷窝的面积和数目，使用SPSS10.0软件包的单因素方差分析比较补肾中药血清对破骨细胞生物学作用的差别； 3.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分离培养破骨细胞(OC)，差异贴壁法获得纯度在95％以上的破骨细胞，分成低、中、高、空白及阳性对照5组，每组6孔，施加相应浓度的补肾中药血清，空白组采用无中药血清，阳性对照组使用17-β雌二醇，在培养的破骨细胞中施加不同浓度的补肾中药血清培养24小时，收集破骨细胞使用TRIzol方法提取总RNA，使用DNAman软件设计引物序列，RT-PCR方法扩增目标片段，使用Hema凝胶图像分析系统检测条带OD值，比较各组目标带与内参的比值，使用SPSS10.0软件包的单因素方差分析反应破骨细胞中RANKmRNA表达水平的变化； 4.取SD大鼠的胎鼠颅骨与四肢骨分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，利用复合培养系统使二者生活在同一环境中，观察细胞的形态变化；在复合培养体系中施加不同浓度的补肾中药血清，并与空白组及雌激素组对照，培养24小时后收集成骨细胞，采用Westernblot方法及RT-PCR杂交法测定OB细胞中OPG/OPGL蛋白的改变及基因表达的变化，使用SPSS10.0软件包的单因素方差分析反应成骨细胞中OPG/OPGL蛋白及mRNA表达水平的变化；酶动力学法测定培养上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，利用甲苯胺蓝对骨吸收陷窝染色并在图像分析仪下测定骨吸收陷窝的面积和数目，使用SPSS10.0软件包的单因素方差分析比较补肾中药血清对共培体系中破骨细胞生物学作用的差别，最后使用SPSS10.0统计分析软件对OPG/OPGL的比值与破骨细胞的活性关系进行相关分析。 结果：1.补肾中药在末次灌胃后1小时达高峰，灭活前补肾中药低、中、高浓度组及空白对照组A570(增殖率％)的值分别为(0.809±0.261)、(0.876±0.274)、(0.851±0.299)、(0.711±0.248)灭活后各组A570(增殖率％)的值分别为(0.669±0.179)、(0.751±0.211)、(0.725±0.209)、(0.454±0.154)，各组成骨细胞的增殖率、ALP的活性在灭活前后的血清干预下有显著性差异，P＜0.01，但灭活血清与对照组比较仍有明显作用，P＜0.01； 2.单独培养的破骨细胞在加入补肾中药血清后培养上清中TRAP活力低、中、高与空白对照组分别是(1.36±0.14)U/L、(1.29±0.18)U/L、(1.31±0.24)U/L、(1.75±0.14)U/L(补肾中药组与对照组相比P＜0.01，补肾中药组间比较P＞0.05)；骨吸收陷窝的面积低、中、高与空白对照组分别是(293.23±190.45)μm2、(335.40±202.33)μm2、(365.70±189.47)μm2、(495.25±210.37)μm2(补肾中药组与对照组相比，P＜0.01，补肾中药组间比较P＞0.05)，骨吸收陷窝数目分别是(11.40±1.50)个、(12.50±1.80)个、(14.40±2.42)个、(18.40±2.32)个(补肾中药组与对照组相比，P＜0.01，补肾中药组间比较P＞0.05)； 3.RT-PCR显示，补肾中药血清能下调破骨细胞中RANKmRNA的表达，低浓度的补肾中药血清即可降低RANKmRNA表达，但无明显剂量相关性(补肾中药组与对照组相比，P值均小于0.05，补肾中药组间比较P＞0.05)，E2下调RANKmRNA的表达更为明显(P＜0.01)； 4.复合培养体系中Westernblotting及RT-PCR显示：补肾中药血清能上调成骨细胞中OPG蛋白及OPGmRNA的表达，下调细胞中OPGL蛋白及OPGLmRNA的表达，低浓度即有效(与对照组吸光度相比P＜005)，不同中药浓度组无明显差异(P＞0.05)；E2上调成骨细胞中OPG蛋白及OPGmRNA降低OPGL蛋白及OPGLmRNA的表达最为明显(与对照组吸光度相比P＜0.01)；补肾中药血清能降低复合培养体系破骨细胞的TRAP的活力，减少骨磨片陷窝吸收面积(补肾中药组与对照组相比，P值均小于0.05)，但亦无明显剂量相关性，不同中药浓度组无明显差异(P＞0.05)，E2下调TRAP活性及减少骨磨片陷窝吸收面积更为明显(P＜0.01)；统计学处理提示TRAP活力与骨磨片陷窝吸收面积服从正相关线性分布；骨磨片陷窝吸收面积和OPG/OPGL服从负相关线性分布。 结论：1.补肾中药在末次灌胃后1小时采血此时的血清含药物有效成分最高，灭活后血清能满足试验要求； 2.补肾中药血清可抑制体外单独培养的破骨细胞的骨吸收功能; 3.补肾中药血清可抑制破骨细胞的RANK基因表达水平； 4.补肾中药血清可抑制体外共育体系中的破骨细胞的骨吸收功能;OPG/OPGL是调节破骨细胞活性的关键性因素，OPG/OPGL的比值与破骨细胞的活性呈负相关。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章中药血清制备方法探讨

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

附图

第二章破骨细胞的培养与鉴定及含药血清对其活性的影响

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

附图

第三章补肾中药对体外培养破骨细胞RANK基因的调控作用

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4 小结

附图

第四章成骨细胞-破骨细胞共育体系的建立及补肾中药血清对共育体系中OPG/OPGL蛋白及基因表达的变化与破骨细胞活性的相关性

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.1小结

附图

总结

参考文献

综述 中西医对骨质疏松症的研究进展

附录 学习期间发表论文及成果

英文缩略语对照表

致谢

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