自体骨髓源性成体干细胞移植治疗急性肾小管坏死的实验研究

摘要

目的： 建立兔肾脏缺血再灌注(ischemic-reperfusion，I/R)损伤诱发急性肾小管坏死动物模型，采用经肾动脉灌注途径向肾脏内移植自体骨髓单个核细胞，观察骨髓源性干细胞对急性肾小管坏死肾功能的影响和骨髓源性干细胞是否具有向损伤肾组织归巢的能力及其在肾脏组织中的分布，初步探讨骨髓源性干细胞移植促进急性肾小管坏死修复的作用和可能机制，以及细胞移植的有效途径，为骨髓源性干细胞移植治疗急性肾小管坏死提供实验依据。 方法： 1.实验动物分组：健康日本大耳白兔42只，随机分成2组，每组21只。①移植组，I/R损伤+自体骨髓单个核细胞肾动脉灌注；②对照组，I/R损伤+等量生理盐水肾动脉灌注。 2.骨髓单个核细胞的制备及细胞标记：兔髂前上嵴局部注射普鲁卡因麻醉后抽取10ml骨髓液，通过密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞，制成细胞悬液，将其移入含10mlDMEM/F12完全培养基的25cm2的培养瓶内，调整细胞浓度为3×105个/ml，加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)，使其终浓度为20μmol/L，对骨髓单个核细胞进行标记，置入体积分数为5％的CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养72h。 3.肾脏缺血再灌注损伤模型制备：以3％戊巴比妥钠(30mg/kg)兔耳缘静脉注射麻醉，采用腹部正中切开术分别暴露右肾和左肾，结扎右肾动脉、静脉和输尿管后切除右肾；钝性分离左肾动脉，用无创动脉夹夹闭左肾动脉105min后取出动脉夹，使左肾动脉血流恢复，造成肾缺血再灌注损伤。通过肾功能相关的血生化指标测定及病理组织学观察确定急性肾衰模型建立成功。 4.骨髓单个核细胞移植：在兔肾脏缺血再灌注损伤模型制备完成并明确左肾动脉血流恢复后于右腹股沟区切开皮肤，钝性分离右股动脉，从右股动脉插入导管至腹主动脉进入左肾动脉约0.5cm处，在腹主动脉与左肾动脉分支处下方0.5cm处以一手指按压腹主动脉以暂时阻断腹主动脉血流，移植组经导管缓慢匀速注射5ml骨髓细胞悬液，细胞数量为1.5×107个，注射完毕后退出导管，缝合血管壁和皮肤；对照组用同样方法注射等量生理盐水。 5.动物一般状况监测：实验期间观察兔饮食、活动、皮毛色泽、体重等变化。 6.血生化指标监测：I/R损伤前(T0)和I/R损伤后第1、3、5、7、14、21、28天(T1、T3、T5、T7、T14、T21、T28)于兔耳缘静脉采血1ml，测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、钾(K+)、钠(Na+)、氯(Cl-)。 7.肾组织病理组织学观察及BrdU免疫组化分析：取I/R损伤前和I/R损伤后第1、3、5、7、14、21、28天的左侧肾组织，进行病理组织切片，分别行HE、PAS、PASM染色和肾组织BrdU免疫组化检测。 结果： 1.一般情况：两组兔I/R损伤后饮水量与I/R损伤前相比均明显增多，进食减少，第7天后进水、进食均逐渐增多并恢复正常；两组I/R损伤后均出现困盹、萎靡、活力下降，3天后移植组精神状态、活动能力明显改善；两组I/R损伤后体毛逐渐干枯，失去光泽，部分出现脱毛，移植组2周后，体毛逐渐开始光滑润泽；两组I/R损伤后体重均下降，七天后体重均逐渐增加，至第4周实验结束时，两组体重均重于实验前，但组间差异无统计学意义(P＞0.05)；实验过程中，对照组于I/R损伤后第1天、第3天各死亡1只，解剖见胸腔内大量胸水，可能与严重的肾功能衰竭有关；移植组于I/R损伤后第7天死亡1只，解剖见肠粘连，腹腔大量脓液，可能与术后感染有关。 2.BrdU标记细胞的浓度和时间：非标记组未见BrdU阳性细胞存在；标记24h、48h、72h三组均见BrdU阳性细胞，BrdU阳性反应物位于细胞核，呈棕色、颗粒状或弥散分布。相同浓度随着标记时间的延长，标记细胞数目逐渐增多；相同时间随着浓度的升高标记细胞数目逐渐增多。以20μmol/L为终浓度培养72h，阳性细胞标记率达到最佳，为(97±2.6)％，增加BrdU标记浓度细胞标记率并未见升高。因此，本实验选用标记72小时、终浓度为20μmol/L作为最佳标记时间和浓度进行后续实验，在相差显微镜下观察细胞的形态、生长、增殖与非标记组相比未见异常。 3.血生化指标：I/R损伤前，两组兔之间SCr、BUN差异无统计学意义(P＞0.05)。I/R损伤后第1天和第3天SCr、BUN均逐渐达到最高水平，但两组间无显著性差异(P＞0.05)，以后SCr、BUN逐渐下降，但移植组下降速度明显快于对照组，第7天后移植组SCr及BUN水平逐渐低于对照组，到实验观察结束时的第28天，对照组SCr和BUN分别为(135.6±32.5)μmol/L和(10.9±2.5)mmol/L，移植组SCr和BUN分别为(90.1±11.1)μmol/L和(8.0±1.5)mmol/L，两组间有显著性差异(P＜0.05)；电解质无明显变化。 4.肾组织病理组织学观察结果：普通病理观察，I/R损伤后肾小管上皮细胞变性、坏死甚至脱落，部分坏死肾小管可见坏死脱落细胞填塞，病变于肾皮质或皮髓交界处明显，而肾小球未见明显异常。随着时间延长，坏死肾小管逐渐修复，但移植组修复程度明显好于对照组。 5.肾组织免疫组化检测结果：肾组织BrdU免疫组化染色结果显示，对照组BrdU染色阴性，而移植组于细胞移植后第5、7天逐渐显示肾小管BrdU阳性染色并持续至实验结束，并随着时间的推移，阳性染色逐渐增强。阳性染色主要分布在肾组织外髓质及皮髓交界处，部分肾小球内亦显阳性染色。 结论： 1.骨髓源性干细胞移植能在一定程度上加速急性肾小管坏死后肾功能的修复。 2.骨髓源性干细胞获取方便，自体移植不会发生免疫排斥反应，是一种治疗急性肾小管坏死的安全而有效的方法。 3.经肾动脉灌注途径移植的骨髓源性干细胞可能更有利于在肾脏归巢和定居，并参与肾组织损伤修复。

目录

文摘

英文文摘

第一章经肾动脉自体骨髓源性干细胞移植对急性肾小管坏死肾功能的影响

第二章 急性肾小管坏死后移植的骨髓源性干细胞在肾脏组织中分布的研究

综述 干细胞移植治疗与急性肾小管坏死

缩略词表

附图及说明

攻读学位期间成果

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